ГОСТ Р 57196—2016
- 15 г агара, взвешенного с погрешностью не более 0.01 г. помещают в колбу вместимостью
1000см3,содержащую 900см3 воды. Колбуставят наводяную баню и нагреваютдо полного расплавле
ния агара;
- 3 г дигидроортофосфата калия, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в
100 см3воды, затем выливаютв расплавленный агар, доводятобъем водойдо 1000см3иперемешива
ют. УстанавливаютpH 8,0 при помощи 30 %-ного раствора гидрооксида натрия. Агаровую среду
кипятят до образования осадка, затем фильтруютчерезтолстыйслой ваты истерилизуютв
автоклавев течение 30 мин при температуре (110 ± 1) °С. pH среды поля стерилизации должна быть
7.8—8.0. Среду хранят при температуре 20—22 °С не болеедвух месяцев.
Среда агаровая питательная; готовят аналогично приготовлению агаровой голодной среды, при
этом взамен воды берут МПБ с содержанием аминногоазота 50—60 мг в 100 см3бульона. Питательную
среду стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре (110 • 1) °С. После стерилизации pH
растворадолжна быть 7.8—8.0. Раствор хранят в течение месяца при комнатной температуре.
Раствор физиологический.
Агар мясо-пептонный (МПА) — среда для культуры Вас. subtilis готовят следующим образом;
МПБ разбавляют водой в соотношении 1:2. К 1000 см3разбавленного МПБдобавляют 20 г агара,
взвешенного с погрешностью не более 0.01 г. Для набухания агара смесь выдерживают в течение
40—60 мин при комнатной температуре.
МПА расплавляют на водяной бане, устанавливают pH 7.2—7.4 при помощи 30 %-ного раствора
гидрооксида натрия, дают среде отстояться в течение 30 мин. после чего среду фильтруют через тол
стый слой ваты, затем разливаютв колбы истерилизуют при температуре (110 i 1) °С втечение 30 мин.
pH среды после стерилизации должен быть7.2—7.4.
Среда для выращивания спор Вас. subtilis 6633 в матрицах готовят следующим образом;
25 гагара, взвешенногос погрешностью не более 0.01 г.добавляют на 1000 см3бульона Хоттинге-
рассодержанием 30—35 % аминногоазота. Полученную средуразливают поматрицам истерилизуютв
течение 30 мин при температуре (110 ± 1)°С. pH после стерилизациидолженбыть 6.0—6.2.
Суспензия тест-культуры Вас. subtilis 6633 готовятследующим образом:
тест-культуруВас. subtilis 6633переносят микробиологическойпетлей в пробирку сфизиологичес
ким раствором, затем пипеткой каплю полученной суспензии переносят в чашки Петри со средой МПА.
растирают ее почашке стеклянным шпателем, после чего этим же шпателем переносятоставшуюся на
нем культуруизчашки вчашкусвышеуказаннойсредойпутем растирания (5—7чашек),добиваясьтаким
образом в последующем роста отдельных характерныхколоний.
Тест-культуру выращивают при температуре 37 еС в течение 18—24 ч. Затем отбирают типичные
колонии — мелкие, сороватые с зубчатым краем и пересевают бактериальной петлей на скошенный
МПАв пробиркуи выращиваетпри температуре 37 °С в течение 18 ч. послечего культурусо скошенного
агара смывают 5—10 см3стерильнойдистиллированной воды и смыв переносят в матрацы. Засеянный
матрац выдерживают при температуре 37 °С в течение 5— 7суток, после чего производят микроскопи
ческий контроль и. если в мазках, окрашенных по Граму. имеется в поле зрения 80—90% спор, делают
смыв культуры стерильнойдистиллированной водой.
Полученную взвесьспор прогреваютпри температуре60—70 °С наводяной баневтечение 30 мин,
затем взвесь спор промывают не менее трех раз стерильнойдистиллированной водой при центрифуги
ровании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор хранят в стерильной
дистиллированной воде взапаянныхампулах или пробирках втечениедвухлет притемпературе от 4 до
10°С.
Бацитрацин основной стандартный растворконцентрации 1000 ЕДв 1см3;раствор готовят следу
ющимобразом. 20 мг стандартногообразца бацитрацин. взвешенныеспогрешностью неболее0,0002 г,
растворяют в рассчитанном объеме раствора соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм3.
Объем раствора соляной кислоты (Х3) в кубическихсантиметрах вычисляют поформуле 3:
у - т в *
А
(3)
31000
’
где т6 — масса стандартногообразца сульфата бацитрацин. мг,
А — активность стандартного образца сульфата бацитрацин. ЕД в 1 мг (весовое выражение 1 ЕД
активности сульфата бацитрацин зависит от активности действующего в настоящее время
стандартного образца);
1000 — активностьосновного стандартного раствора сульфата бацитрацин. ЕД в 1см3.
Полученный раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре 4 °С в защищенном от
света месте не более одного месяца.
7