ГОСТ Р 57196—2016
Бацитрацин рабочий стандартный раствор концентрации 3 ЕД в 1см3; готовят следующим обра
зом:
1 см3основного стандартного раствора переносят в мерную колбувместимостью 100 см3,доводят
до метки лимоннокислым буферным раствором, получая разведение 1:100 (10 ЕД в 1см3). Затем берут
пипеткой 3 см3этого разведения, помещают в пробирку, добавляют 7 см3 лимоннокислого буферного
раствора.
5.5.2Подготовка к испытанию
5.5.2.1 Приготовление раствора испытуемого препарата
5 г пробы, взвешенной с погрешностью не более 0.01 г. помещают в ступку, заливают 25 см3соля
ной кислоты концентрации 0,2 моль/дм3и растираютпестиком. Затем взвесь переносят в колбу илиста
кан. а ступкусмывают25 см3 растворасоляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм3 исмывдобавляют в
колбу.
Взвесь препарата выдерживают в течение 2—3 ч при комнатной температуре для экстракции
бацитрацин, периодическивзбалтывая, послечегосодержимоеколбыцентрифугируютпри 2000мин■’ в
течение 10—15 мин и фильтруют через бумажный фильтр, получая таким образом разведение 1:10.
Затем изэтого раствора готовятследующиеразведения с помощьюлимоннокислого буферного раство
ра (с учетом предыдущегоразведения 1:10):
для бацилихина-10 — 1:1000; 1:2000:1:4000;
для бацилихина-40 — 1:4000; 1:8000; 1:16000.
5.5.2.2 Подготовка чашек Петри с питательной средой и тест- культурой
Чашки Петри тщательно моют, стерилизуют в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре
160 °С.
В 6 чашек Петри заливают пипеткой по 15 см3расплавленной голодной агаровой среды, получая
нижнийслой. В 100 см3расплавленнойи охлажденнойдо 60—65 еС питательной агаровой среды вносят
1см3(10 международных единиц мутности) тест-культуры Вас. subtilis 6633 и разливают в чашки Петри
на застывший нижний слой голодной агаровой среды по7—8 см3.
После застывания агара в чашкахделают по 6 лунок буром, которые располагают по радиусам на
расстоянии 2.8 см от центра чашки с интервалом около 60’. В 6 лунок каждой из двух подготовленных
чашек Петри вносят капельницей около 0,1 см3 рабочего стандартного раствора бацитрацин. Чашки
помещают втермостатпри температуре 37вСивыдерживаютв течение 16— 18ч. а затем измеряютдиа
метры зон задержки роста тест-микроба.
Для проведенияиспытаний препарата насодержание в них бацитрацина используютпартию пита
тельной агаровой среды, обеспечивающей после действия рабочего стандартного раствора бацитра
цинзоны задержкидиаметром от 17до 21 мм. Вслучае получения зон задержкидиаметром менее 17мм
или более 21 мм готовят новую партию сроды. подбирая новые серии компонентов, или увеличивают
(уменьшают)количествотест-микроба, вносимого в питательную среду, с цельюдостижения оптималь
ного размера диаметра зон задержки роста тест-микроба.
5.5.2.3 Построение градуировочного графика для определения активности бацитрацина
Для построения градуировочного графика из раствора, содержащего 10 ЕД в 1см3, готовят 5 рас
творовконцентрациями 1.8; 2.4:3,0; 3.8.4,5 ЕДс 1см3. Раствор, содержащий3 ЕДв 1см3,является конт
рольным.
Полученные стандартные растворы, за исключением контрольного, капельницей вносят в 3 лунки
(по 3 чашки на каждую концентрацию). Контрольный раствор вносят в остальные 3 лунки всех 15 чашек.
Объем вносимых растворов (стандартного и контрольного) должен быть равным и составлять около
0.1 см3.Передработой капельницутщательноополаскиваютбуферным раствором, а затем раствором,
который следует вносить в каждуюлунку. Чашки выдерживают втечение 16—18ч в термостатепри тем
пературе 37 °С. затем измеряютдиаметры зон задержки ростатест- культуры.
Для каждой концентрации рассчитываютсреднее арифметическоедиаметров зон задержки роста
по 3 чашкам. Для контрольной концентрации подсчитывают среднее арифметическое диаметров зон
задержки роста отдельно по 3 чашкам и по всем 15 чашкам, находят поправку, которая представляет
собой разность между средними арифметическими контрольных зон задержки роста, вычисленных по
15 ипо 3 чашкам.
Полученные поправки прибавляют к средним значениям диаметра зон задержки роста стандар
тных растворов концентрации 1,8; 2.4; 3,0; 3,8; 4.5 ЕД в 1см3, вычисленных по 3 чашкам.
По полученным данным на полулогарифмической сетке строят градуировочный график. На ось
абсцисс наносят средние значения диаметра зон задержки роста стандартных растворов, полученных
8