ГОСТ 13496.21— 2015
9.5.2 Проведение щелочного гидролиза анализируемой пробы для определения массовой
доли триптофана
Щелочной гидролиз анализируемой пробы проводят по 8.5.2.1 и 8.5.2.2.
9.5.3 Нанесение растворов на пластинки
Гидролизаты (см. 9.5.1 или 9.5.2) и градуировочные растворы лизина и триптофана (см. 9.3.10)
наносят на полоски хроматографической пластинки микрошприцом в токе теплого воздуха. Нанесенный
на полоску раствор высушивают. Операцию нанесения и высушивания раствора повторяют до тех пор.
пока не будет нанесена вся микродоза.
Для проб с массовой долей лизина до 1.0 % итриптофана — до 0.2 % наносят 0,010 см3 гидролиза
та. для проб с большим содержанием аминокислот — 0.005 см3. На каждую пластину наносят такие же
объемы трех градуировочных растворов аминокислот с массовыми концентрациями, близкими к кон
центрациям определяемых аминокислот в гидролизатах.
9.5.4 Хроматографирование
9.5.4.1 Проведение хроматографии для лизина
Пластинку с нанесенным гидролизатом накладывают обратной стороной на стекло такого же
размера. К верхнему краю пластинки прикрепляют фильтровальную бумагу размером 20 х 15 см так.
чтобы она закрывала верхний край ионообменного слоя шириной 1 см. а свободный загибают на проти
воположную сторону стекла. На край бумаги, закрывающий ионообменный слой, накладывают полоску
органического стекла и закрепляют резиновым кольцом. Затем пластинку помещают в предварительно
нагретую до температуры 60 °С хроматографическую камеру так. чтобы нижний край был погружен в
буферный раствор с 3,3 од. pH (см. 9.3.3) на 1 см. Камору герметично закрывают и помещают в тер
мостат. Хроматографирование проводят при температуре 60 вС в течение 5 ч.
9.5.4.2 Проведение хроматографии для триптофана
Пластинку с нанесенным гидролизатом накладывают обратной стороной на стекло такого же
размера и помещают в предварительно нагретую до температуры 30 °С хроматографическую камеру
так. чтобы нижний край был погружен в буферный раствор с 6.0 ед. pH (см. 9.3.3) на 1см. Камеру герме
тично закрывают и помещают в термостат. Хроматографирование проводят при температуре 30 °С в
течение Зч.
9.5.5 Проявление хроматограммы
По окончании хроматографированияпластинки вынимают из камерыи высушиваютпри комнатной
температуре в вытяжном шкафу. По всей поверхности пластинки распыляют пульверизатором кадмие-
во-нингидриновый реактив (см. 9.3.6)до полного смачивания. Реактив наносят равномерно, недопуская
подтеков. После опрыскивания пластинку высушивают на воздухе в вытяжном шкафу и помещают на
ночь в термостат при температуре 30 °С для полного развития окраски зон аминокислот.
9.5.6 Денситометрирование
Пластинку разрезают наотдельные хроматограммы иденситометрируют при длине волны 530 нм.
В результате получают денситограмму с пиками, площади которых пропорциональны концентрациям
аминокислот.
Площадь пика определяют по 8.5.3.3.
9.5.7 Построение градуировочного графика
Градуировочный графикстроят для каждой хроматографической пластинки. На оси абсциссоткла
дывают концентрации трех градуировочных растворов а поосиординат — соответствующие имплоща ди
пиков.
По построенному градуировочному графикуопределяют массовую концентрациюаминокислоты в
гидролизате анализируемой пробы.
9.6 Обработка результатов
Массовую долю аминокислоты X, %. вычисляют по формуле
т
где С, — массовая концентрация аминокислоты в гидролизате пробы, найденная по градуировочному
графику, мг/см3;
V
— конечный объем гидролизата, см3;
100 — коэффициент пересчета в проценты;
т
— масса навески, взятая для гидролиза, мг.
Вычисления проводят до третьего десятичного знака с последующим округлением до второго
десятичного знака.
ю