ГОСТ Р 56919—2016
- смесьдезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ);
- олигомуклеотидные праймеры, которые должны обладать 100 %-мой специфичностью к ампли-
фицируемому фрагменту ДНК;
- ДНК-полимеразу с высокопроцессивной 5’-*3’ ДНК полимеразной активностью, корректирующей
3’-*5’ экзонуклеаэной активностью и горячим стартом, котораядолжна позволять амплификацию малых
количествДНК и сложных смесей ДНК.
6.3 Набор контрольных образцов должен включать;
- положительный контрольный образец, имеющий идентичность с тестируемым участком генома
идентифицируемого объекта;
- отрицательный контрольный образец — ДНК организма, близкородственного идентифицируемо
му данным ПЦР-набором;
- положительный контроль ПЦР — ДНК организма с секвенированным геномом и специфические
праймеры к участку геномнойДНК этого организма;
- отрицательный контроль ПЦР — стерильную деионизированную воду;
- ГСО специфического фрагмента нуклеиновых кислот, имеющих 100 %-ную идентичность с тести
руемым участком генома идентифицируемого объекта. — для Тест-ПЦР-набора.
7 Требования к проведению испытаний ПЦР-наборов с применением
Тест-ПЦР-наборов для подтверждения их соответствия заявленным
характеристикам
7.1 Тест-ПЦР-набор должен содержать реактивы для проведения ПЦР, ГСО. схему проведения ис
пытаний.
7.2 Для подтверждения соответствия ПЦР-наборов заявленным характеристикам специфичности
проводят лабораторные испытания с использованием Тест-ПЦР-набора и шифрованных образцов.
7.2.1 Шифрованные положительные иотрицательныеобразцыдля подтверждения специфичности
ПЦР-наборов формируется заказчиком испытаний ПЦР-набора и включает.
- шифрованные положительные образцы (в количестве не менее трех), которые включают генно-
инженерную конструкцию, содержащую фрагмент ДНК целевого таксона, в разных концентрациях;
- шифрованные отрицательныеобразцы(вколичестве не менеетрех), которые включаютобразцыДНК.
характеризующиеся отсутствием перекрестных реакций с праймерами кфрагменту ДНК целевого таксона.
С целью исключения ложноотрицательных результатов в тестирование ПЦР-наборов может быть
включен внутренний контрольный образец, в качестве которого используют ДНКфагалямбда, праймеры и
условия амплификации, предложенные фирмой Perkin Elmer Cetus (США) в наборе GeneAmp kit.
7.2.2 Вид испытаний (внутрилабораторных или межлабораторных) определяется заказчиком.
7.2.3 Оценку характеристик специфичности ПЦР-наборов проводят по результатам их испытаний.
7.2.4 Результаты испытаний по характеристикам специфичности определяют путем сопоставле
ния данных, полученных с применением испытуемого ПЦР-набора и соответствующего ему Тест-ПЦР-
набора в течение одного интервала времени на идентичных анализируемых пробах в одной и той же
лаборатории одним и тем же оператором, с использованием оборудования и схемы проведения иденти
фикации соответствующего ПЦР-набора. указанных в инструкции к ПЦР-набору.
7.2.5 Результаты испытаний должны ясно констатировать обнаружение нуклеотидной последова
тельности целевого таксона; необходимо выявить полное соответствие полученных размеров амплифи-
цируемых фрагментов целевого таксона с использованием испытуемого ПЦР-набора и соответствующе го
ему Тест-ПЦР-набора.
П р и м е ч а н и е — Соответствие размеров амппифицируемыхфрагментов целевого таксона, полученных
с использованием испытуемого ПЦР-набора и соответствующего ему Тест-ПЦР-набора, определяют путем приме
нения маркеров молекулярных масс ДНК. которые включают фрагмент ДНК. имеющий размер, соответствующий
размеру амплицифированного фрагмента целевого таксона.
7.2.5 Интерпретация полученных результатов по характеристикам специфичности ПЦР-наборов и
принятие решения
В результате испытаний по характеристикам специфичности с использованием испытуемого
ПЦР-набора и соответствующего ему Тест-ПЦР-набора амплифицируемая последовательность целе
вого таксона может быть, а может и не быть обнаружена. В таблице 1 описаны четыре
альтернативных случая и соответствующие результаты, которые должны быть включены в протокол.
3