ГОСТ 33528—2015
9 Проведение анализа
При сборке камеры для полимеризации геля применяют стеклянные пластины размерами: вну
тренний размер — 200 х 200 мм и внешний размер — 200 х 225 мм.
На внешнюю пластину справа и слева вдоль длинных сторон помещают спейсеры (ограничитель
ные пластинки) толщиной 1 мм. Поверх спейсеров накладывают внутреннюю стеклянную пластину.
Пластины фиксируют зажимами справа и слева и устанавливают на подставку для заливки с желобом
для выравнивания. Камору проверяют на герметичность с помощью дистиллированной воды,
которую затем удаляют. После проверки камеры на герметичность между пластинами камеры под
небольшим углом помещают гребенку для формирования лунок.
Для обеспечения нормального процесса полимеризации геля раствор мономеров, приготовлен
ный по 8.1.6. подвергают деаэрации в колбе с тубусом, присоединенной к водоструйному насосу. По
сле деаэрации в раствор добавляют (0.020 ± 0.001) г надсернокислого аммония и 0,020 см3 N. N. N’,
N’-тетраме-тилэтилендиамина, осторожно перемешивают для предотвращения образования пузырей в
растворе. Стеклянной пипеткой с грушей вдоль края спейсера (с приподнятой стороны гребенки) рас
твор вносят в камеру для полимеризации.
Гель полимеризуется в течение 45 мин. после чего гребенку извлекают и ополаскивают образо
вавшиеся в геле лунки дистиллированной водой.
Камеру с гелем прикрепляют к термостатируемому резервуару и помещают в электрофоретиче
скую ячейку.
В электродные камеры ячейки заливают электродный буфер, приготовленный по 8.1.7.
В лунки геля под электродный буфер с помощью микрошприца вносят раствор белков контроль
ной пробы, приготовленной по 8.4.1, и растворы белков анализируемых проб, приготовленные по 8.4.2.
Крайние лунки геля используют для растворов контрольной пробы. Обьем раствора белка, вносимого в
одну лунку, составляет 0.020—0.025 см3. После каждого внесения микрошприц тщательно промывают
раствором электродного буфера.
П р и м е ч а н и е — При наличии в пластине пустых ячеек в них вносят раствор белков контрольной пробы,
приготовленный по 8.4.1.
Для получения достоверных результатов раствор белков каждой анализируемой пробы вносят не
менее чем в три лунки.
После внесения растворов белков контрольной и анализируемых проб электрофоретическую
ячейку закрывают крышкой.
Электрофорез проводят в течение 4—5 ч в режиме постоянного напряжения 150—170 В.
П р и м е ч а н и е — Режим приведен для электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в 7. и
полиакриламидного геля размером 160 х 160 х 1 мм. При использовании ячейки другого типа или геля с другими
размерами режим проведения электрофореза подбирается индивидуально.
Для предотвращения неравномерного распределения тепла и искажения белковых зон (полос)
необходимо обеспечить принудительное охлаждение термостатируемого резервуара.
Электрофорез считают законченным, когда лидирующий краситель опустится до нижнего края
геля.
После проведения электрофореза гель аккуратно извлекают из электрофоретической ячейки,
фиксируют и окрашивают. Фиксация и окраска осуществляются одновременно в растворе, приготовлен
ном в соответствии с 8.1.8. в течение 2 ч. Для ускорения процесса допускается проводить окрашивание и
фиксацию геля в течение 1ч на электроплитке при (40 ± 5) °С. при этом ванночку с раствором и гелем
необходимо регулярно покачивать.
Отмывку окрашенного геля проводят кипячением в растворе для отмывки, приготовленном по
8.1.9. до полного удаления фона с постоянной сменой отмывающего раствора по мере вымывания
красителя.
8