ГОСТ ISO 9167-1—2015
Смешивают 10 г смолы DEAE Sephadex А25 (или аналогичной смолы) в избытке раствора ук
сусной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм3. Дают отстояться. Добавляют раствор уксусной
кислоты 2 моль/дм3. пока объем жидкости не будет равен двойному объему осадка.
4.8Сульфатаза, Helix pomatia тип Н1 (3.1.6.1), имеющая активность более чем 0,5 единиц
активности на кубический сантиметр раствора очищенной сульфатазы
Очистку, определение активности и разведение сульфатазы проводят в соответствии с мето
дом, установленным в 4.8.1—4.8.4.
4.8.1 Подготовка ионообменных колонок
Обрезают пять пипеток Пастера (5.9) на 7 см выше кончика и вкладывают тампон из стекловаты
(5.8) в отверстие пипетки. Пипетки ставят в вертикальном положении в штативе и вносят в каждую
достаточное количество ионообменной смолы (4.7) таким образом, чтобы после стекания воды
объем ионообменной смолы составлял 500 мм3.
В каждую пипетку добавляют 1 см3раствора формиата имидазола (4.4) и промывают дважды
порциями воды по 1 см3.
4.8.2 Очистка
Взвешивают с точностью до 0.1 мг 25 мг Helix pomatia типа Н1 (4.8). растворяют в 2,5 см3воды и
переносят 500 мм3 полученного раствора в каждую колонку, подготовленную по 4.8.1. Промывают
каждую колонку 1,5 см3 воды и элюат отбрасывают. Затем добавляют 1,5 см3 раствора ацетата
натрия (4.3) и собирают элюаты из пяти колонок в пробирку.
Концентрируют элюаты путем фильтрования, используя иммерсионный фильтр MiHIpore PTGC
11К2511, до тех пор. пока не останется приблизительно 100 мм3 жидкости (сульфатаза с молярной
массой более 5000 не удаляется). Вносят 2,5 см3воды и концентрируют еще раз с помощью филь
трации. пока не останется приблизительно 100 мм3 жидкости. Разводят до 2.5 см3 водой и хранят
очищенную сульфатаэу в морозильной камере при температуре минус 18 ‘С в небольших количе
ствах для того, чтобы было удобно размораживать небольшое количество перед непосредственным
использованием.
4.8.3 Определение активности сульфатазы
4.8.3.1 Приготовление раствора синигрина молярной концентрации 0,15 ммоль/дм3, с pH 5.8
Приготавливают три раствора в следующей последовательности:
a) вносят 1см3уксусной кислоты в мерную колбу вместимостью 500 см3 идоводят водойдо метки;
b
) вносят 1 см3этилендиамина в мерную колбу вместимостью 500 см3и доводят водой до метки;
c) смешивают 73 см3раствора а) с 40 см3раствора Ь) и регулируют pH на уровне 5.8, используя
раствор а) или Ь) по мере необходимости.
Вносят 3 см3раствора синигрина молярной концентрации 5 ммоль/ дм3(4.5.1.1) в мерную колбу
вместимостью 100 см3и доводят объем до метки раствором с).
4.8.3.2 Определение активности
Используя пипетку, переносят 2 см3раствора синигрина (4.8.3.1) в сравнительную и измеритель
ную ячейки спектрофотометра (5.3) с установленной длиной волны, равной 229 нм и с температурой
ячеек 30 ’С. В момент времени t = 0 вносят 50 мм3очищенной сульфатазы (4.8.2) в измерительную
ячейку и незамедлительно включают регистрацию. Останавливают регистрацию, когда оптическая
плотность более не изменяется (До), строят касательную к точке / = 0 и измеряют градиент ДА/At.
Активность сульфатазы (т. е. высвобождение 1 мкмоль десульфированного синигрина в минуту
при температуре 30 С и pH = 5.8). выраженная в единицах активности на кубический сантиметр рас
твора сульфатазы, вычисляют по формуле
10
АЛV1000.
----------------------------- е.
At Ае50
где AAJAt — градиент касательной к точке t = 0. в единицах оптической плотности в минуту;
V— объем содержимого в процессе реакции, дм3(т. е. 2,05 10~3 дм3);
At — разница между молярным коэффициентом поглощения синигрина и десульфосинигрииа
при 228 нм (приблизительно 1 500 дм3моль-1 см-1), т. е.
11Millipore PTGC 11К25 — пример коммерчески доступного продукта. Данная информация приведена для
удобства пользования настоящим стандартом и не означает рекламу данного продукта.
3