ГОСТР ИСО 16256—2015
3.3.5Приготовление тестовых планшетовдля микроразведения в бульонедля прочтения
с помощью спектрофотометра
3.3.5.1 Путь спектрофотометрического чтения
Рабочие растворы распределяют в 96-луночмые плоскодонные одноразовые пластиковые план
шетыдля микроразведения по 100 мкл налунку сдвойной конечной концентрацией антимикотического
препарата в растворедвойной концентрации.
При испытаниикаждого штаммадля контроля ростадолжна быть включена какминимум одналун
ка в каждом ряду, содержащая 100 мкл среды без антимикотического препарата. Также, для каждого
испытуемого штамма, должна быть использована неинокулированная лунка, содержащая 200 мкл сре
ды без антимикотического препарата, каклунка отрицательного контроля.
3.4 Хранение планшетовдля микроразведения
Заполненные планшеты можно использоватьсразу же. либо незамедлительно поместить в моро
зильнуюкамерув запечатанныхпластиковыхпакетах (CLSI метод, визуальноечтение: притемпературе
минус 70X до6 мес; EUCAST метод, спектрофотометрическое чтение: при — 70 X и нижедо 6 мес или
при температуреминус20X не болеечемнаодинмесяц). Допустимыйсрокхраненияустанавливаютна
основании предписаний изготовителялекарственного средствадля отдельныхсоединений ивсоответ
ствии сдопустимыми пределами КК (контроля качества). Планшеты не следуетхранитьв саморазмора-
живающихся морозильных камерах и допускать их таяния. Антимиотические препараты не должны
повторно замораживаться, так как повторные циклы замораживания — оттаивания ускоряют
инактивацию некоторых антимикотических препаратов.
3.5 Приготовление инокулюма
3.5.1 Общие положения
Стандартизация инокулюма необходимадля точныхивоспроизводимыхтестовчувствительности
методом разведения в бульоне.
Все изоляты должны быть пересеяны на неингибированную агаризованную среду в целяхобеспе
чения чистоты ижизнеспособности.
3.5.2 Приготовление инокулюмадля визуального чтения тестов
Инокулюм должен быть приготовлен путем отбора пяти колонийдиаметром приблизительно 1 мм
из20-часовых(12 ч) культурCandidaspp. либо46-часовых (±2 ч)культур С. neoformans. Колониидолжны
быть суспендированы в 5 мл стерильного 0.85 % физиологического раствора либо стерильной воды.
Следует учесть, что у С. neoformans низкая скорость роста. Оптимальная температура для роста С.
Neoformansсоставляет30 X .
Полученную суспензию перемешивают в течение 15 с, плотность клеток устанавливают спектро
фотометрически путем добавления достаточного количества стерильного физиологического раствора
либо стерильной воды до достижения оптической плотности, эквивалентной производственному стан
дарту 0.5 по МакФарланду (см. приложение В) при длине волны 530 нм. Эта процедурадаст дрожжевую
суспензию от 10едо 5 -106 КОЕ/мл.
Заданную суспензию дрожжей перемешивают на вортексе, разбавляют 1 : 50 соответствующим
вариантом среды бульона RPMI-1640 и повторно разбавляют 1 : 20 средой для получения конечного
инокулюма двойной концентрации (103до 5 103 КОЕ/мл). Инокулюм (двойной концентрации) разво
дят 1:1, если лунки засеяны 100 мкл инокулюма. что приведет кжелаемому конечному количеству ино
кулюма от 0.5 103до 2,5 •103 КОЕ/мл.
3.5.3 Приготовление инокулюма для спектрофотометрического чтения тестов
Инокулюм должен быть приготовлен путем отбора пяти колонийдиаметром приблизительно 1мм
из 18 — 24-часовых культур Candidaspp. либо 46-часовых(±2ч) культур С. neoformans. Колониидолж
ны бытьсуспендированы в 5 мл стерильнойдистиллированной воды.
Полученную суспензию перемешивают в течение 15 с. плотность клеток устанавливают спектро
фотометрически путем добавления достаточного количества стерильного физиологического раствора
либо стерильной воды до достижения оптической плотности, эквивалентной производственному стан
дарту 0,5 по МакФарланду (см. приложение В) при длине волны 530 нм. Эта процедурадастдрожжевую
суспензию от 106до 5 ■10б КОЕ/мл.
Заданную дрожжевую суспензию перемешивают на вортексе, разбавляют 1:10 стерильной дис
тиллированной водой для получения тестового инокулюма двойной концентрации (от 105 до 5
•105КОЕ/мл). Инокулюм (двойной концентрации) разводят 1:1, если лунки засеяны 100 мкл инокулю ма,
что приведет кжелаемой конечной концентрации инокулюма от 0,5 105до 2,5 105КОЕ/мл.
7