ГОСТ ISO 16472—2014
Приложение В
(справочное)
Стандартизация рабочего раствора термостабильной альфа-амилазы
В. 1 Раствор термо-стабильной амилазы или экстракт порошка энзима стандартизируют таким образом,
чтобы двукратное внесение раствора энзима по 2 см5обеспечило удаление крахмала из 0.5 г сырого кукурузного
крахмала.
a) Взвешивают (0.5 ± 0,005) г высушенной и очищенной от оболочек дробленой кукурузы в каждую из ше
сти колб, подобных тем. которые используются для экстракции пробы.
b
) Предварительно нагревают калиброванные установки для кипячения с обратным холодильником, го
товят ледяную баню со льдом для охлаждения стаканов (содержащую достаточно льда для поддержания темпе
ратуры 1“С) и готовят баню с умеренной температурой (узкий поддон, содержащий воду с температурой 20 ’С
и глубиной, превышающей высоту растворов в емкостях. Добавляют в колбы 50 см3раствора ИД (не добавляют
сернистокислый натрий), перемешивают круговыми движениями, и помещают, с интервалами в 1 мин. на пред
варительно нагретую установку для кипячения с обратным холодильником.
c) Когда НД начнет закипать (приблизительно 5 мин), добавляют одну из шести доз основного раствора
или экстракта порошка (в геометрической прогрессии: например. 0 см2. 0.025 см3. 0.05 см1. 0.10 см3. 0,20 см1и
0.40 см2; точные дозы зависят от источника амилазы) в колбы в возрастающем порядке.
d) Кипятят в течение 10 мин, снимают с интервалами в 1 мин. добавляют вторую дозу амилазы (в соот
ветствии с первой), перемешивают и ополаскивают стенки колб, используя минимум ИД комнатной температу ры.
f) Подвергают реакции со второй дозой в течение 60 с и фильтруют через стекловату или двойной слой
марли в стеклянный стакан вместимостью 100 см3. Готовят холостой опыт путем добавления двух средних доз к 40
см1раствора НД комнатной температуры в стеклянном стакане вместимостью 100 см3.
д) Стаканы, за исключением холостого опыта, помещают в ледяную баню. Через 5 мин их удаляют из ле
дяной бани (температура растворов должна быть около 1 ’С) и все стаканы помещают в баню с умеренной тем
пературой (20 “С).
h) Когда температура растворов достигнет (20.0 г 0,5)*С (более 5 мин), стаканы вынимают из бани с уме
ренной температурой и расставляют в порядке увеличения доз энзима на белом фоне в заднем плане.
i) Быстро в стаканы добавляют 0,5 см2раствора иода и перемешивают.
j) Через 90 с смотрят через растворы сверху и быстро (до истечения 120 с) приходят к решению о цвете
каждого раствора, пользуясь следующей шкалой:
- пурпурный раствор означает нехватку энзима;
- розово-янтарный или янтарный раствор означает нехватку энзима:
- светло-желтый раствор означает достаточность энзима.
(сравнивают с холостым опытом; коричневый оттенок раствора энзима не следует путать с розово
янтарным или янтарным).
Если различия цвета неясные, стаканы помещают в баню с умеренной температурой на 5 мин и повторя
ют от h) до j).
k)После идентификации минимальной дозы (V^)- которая имеет светло-желтый цвет, и следующей ми
2
l
нимальной дозы (V-j). которая имеет розово-янтарный или янтарный цвет при использовании геометрической
прогрессии, проводят финальную стандартизацию, используя дозу ниже розово-янтарной (V_j) и линейную про
грессию доз (0.25Уч) между Vj и V [например, если 0.05 см2янтарная (1/^) и 0.10 см2светло-желтая (V^)- при
финальной стандартизации используют дозы 0.025. 0,05, 0,0625. 0.075. 0.0875 и 0.10 см2] основного раствора.
) Минимальная доза, имеющая светло-желтый цвет (и превышающая максимальную недостаточную дозу
с розово-янтарным или янтарным раствором), представляет объем основного раствора амилазы или экстракта
(Vs), который используется для приготовления рабочего раствора амилазы.
Регистрируют дату и серию или партию амилазы, испытанные дозы, количество использованного раство
ра иода и цвет, конечную температуру (до добавления раствора иода) каждой дозы в журнале приготовления
реактивов.
п) Определяют число проб (л), которые предстоит анализировать в следующие пять или менее дней. Для
двукратного внесения по 2 см1рабочего раствора амилазы для каждой пробы требуется общий обьем рабочего
раствора амилазы л к 4 см2. Смешивают n{2Vs) см2основного раствора амилазы с л<4- 2VS) см1воды. Рабочий
раствор амилазы хранят в холодильнике в течение не более пяти дней в закрытой пробкой посуде .
о) Поддерживают качество рабочего раствора амилазы повторением процедуры стандартизации, исполь
зуя кукурузную муку с 0. 2 и 4 см1рабочего раствора (каждый раствор добавляют во время кипения и после сня
тия с установки для кипячения с обратными холодильниками). Если нет заметной разницы в цвете между 2 и 4
см2рабочего раствора, тогда две добавки по 2 см2достаточны для аНДК метода.
Время и температура являются критическими для надлежащей оценки дозы амилазы. Растворы должны
иметь температуру 20 "С. и решение о цвете раствора должно быть принято в течение от 90 до 120 с после до
бавления раствора иода. Розово-янтарный и янтарный цвета быстро блекнут, и ожидание в течение более 120 с
12