ГОСТ 32198—2013
Для приготовления реактива 4 берут 0,5 г кристаллвиолета и растворяют в 100 см3этилового
спирта.
Срок хранения в сухом защищенном от света месте при при комнатной температуре — не более
30 дней.
7.2.10.2 Раствор для окрашивания микроорганизмов (реактив 5)
К 70 см30,5 %-ного спиртового раствора йодистого калия добавляют 10 см35 %-мого спиртового рас
твора основного фуксина. 10 см310 %-ного спиртового раствора йода и 10 см3ацетона. Растворение
йодистого калия лучше проводить, подогревая раствор в водяной бане при температуре 45 °С — 50 °С.
Срок хранения во флаконах темного стекла при комнатной температуре — не более одного го
да.
8 Методы испытаний
8.1 Определение общего количества микроорганизмов
8.1.1 Проведение исследования
Сперму высевают в таком количестве, чтобы на чашках вырастало не более 500 колоний (КОЕ)
микроорганизмов.
Посев материала проводят из двух разведений спермы — 1:10 и 1:1000. приготовленных по 6.3,
на четыре чашки от каждого разведения с использованием двуслойного агарового метода.
Посев спермы на поверхность МПА проводят на заранее разлитую среду в бактериологические
чашки. Толщина среды на дне чашки должна быть не менее 3 мм. Перед посевом бактериологиче ские
чашки с разлитым агаром выдерживают в термостате при температуре (37.5
±
0.5) °С в течение 24 ч
(проверка на стерильность).
При посеве на поверхность МПА суспензию спермы равномерно распределяют по всей поверх
ности агара путем покачивания чашки или стерильным шпателем.
После посева чашки со слегка приоткрытыми крышками ставят в термостат для подсыхания. Затем
чашки закрывают, переворачивают крышками вниз, и выдерживают в термостате в течение 48-72 ч при
температуре (37.5
±
0.5) вС.
Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном на тем
ном фоне. При подсчете пользуются лупой или прибором для счета колоний.
При небольшом количестве выросших колоний их подсчитывают на всей площади чашки и от
мечают на ней восковым карандашом или чернилами. При сравнительно большом росте микроорга
низмов дно чашки делят карандашом на секторы (2. 4, 8) и подсчитывают число колоний отдельно в
каждом секторе. Полученные числа складывают. При равномерном распределении колоний можно
ограничиваться подсчетом на ’Л или V* площади чашки.
При большом количестве выросших колоний (более 500) пользуются камерой Вольфгюгеля. Для
подсчета чашку кладут под стеклянную пластинку и подсчитывают при ярком боковом освещении.
При сравнительно равномерном распределении колоний их подсчитывают в десяти квадратах, рас
положенных в разных участках чашки. Число колоний суммируют.
8.1.2 Обработка результатов
Количество микроорганизмов в 1 см3неразбавленной спермы С при небольшом количестве вы
росших колоний вычисляют по формуле
С
N D
V S
(D
где N — количество насчитанных колоний, шт.;
D — разведение спермы;
V— объем суспензии, взятой для посева, см3;
S — относительный размер площади чашки, на которой был проведен подсчет колоний, см3
Площадь всей чашки, на которой проводят подсчет колоний микроорганизмов, принимают за 1,
площадь половины чашки — 0,5; четверти — 0,25.
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое результатов четырех
определений. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать
20
% .
9