ГОСТ Р 53973—2010
4.4 Подготовка пробы
4.4.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 20264.0.
Анализируемые образцы ферментных препаратов в форме порошка или жидком виде можно ис
пользовать без предварительной подготовки.
4.4.2 Приготовление основного раствора анализируемого образца ферментного препарата
В стаканчик для взвешивания помещают сухой анализируемый образец ферментного препарата
массой (0.1000 i 0.0002) гили жидкий ферментный препарат массой (1.00 ± 0.02) г и суспендируют в не
большом количестве дистиллированной воды. Суспензию количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 100 см3,доводят объем до метки дистиллированной водой при 20 °С и тщательно пере
мешивают. Приготовленный раствор ферментного препарата является основным раствором анализи
руемого образца.
4.4.3 Приготовление рабочего раствора анализируемого образца ферментного препарата
Рабочий раствор анализируемого ферментного препарата готовят из основного раствора по4.4.2
путем дальнейшего разведения его дистиллированной водой таким образом, чтобы при определении
активности оптические плотности опытного и контрольного растворов находились в пределах рабочей
зоны градуировочного графика по 4.3.6.
Количество фермента, взятого на анализ, должно быть рассчитано так. чтобы в реакционной сме
си по4.5.1.2 присутствовал избыток субстрата ичтобы измеряемые величины оптической плотности Оф
по 4.5.1.5 при колориметрировании в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм лежали вдиа
пазоне значений 0.8—1,1.
При отклонении оптической плотности от указанных значений необходимо подобрать разведение
препарата таким образом, чтобы оптическая плотность окрашенных растворов Оф по 4.5.1.5 соотве
тствовала указанным пределам диапазона.
Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях. Для анализа берут
две параллельные навески препарата.
Рабочий раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.
4.5 Проведение анализа
4.5.1 Проведение ферментативной реакции
4.5.1.1 В две опытные пробирки (16
х
150 мм) вносят по 0.5 см3субстрата р-глюкана по 4.3.4. В
пробирки добавляют по 0.3 см3дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают и про
гревают в ультратермостате с температурой (50 ± 1) °С в течение 5 мин.
4.5.1.2 В пробирки добавляют по 0.2 см3рабочего раствора анализируемого образца ферментно
го препарата по 4.4.3, предварительно прогретого до температуры (50 ± 1) вС. и тщательно перемеши
вают. Реакционную смесь инкубируют при температуре (50
1
1) “С в течение 10 мин. ведя отсчет с
момента начала ферментативной реакции.
4.5.1.3 По окончании реакции впробирки вносят по 1см3реактива Шомоди по4.3.2, тщательно пе
ремешивают, закрывают стеклянными пробками, помещают в кипящую водяную баню на 20 мин.
4.5.1.4 Пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют 1.0 см3реактива Нельсона по 4.3.3, пе
ремешивают и инкубируют 10 мин при (20.0 ± 0,2) °С. периодически тщательно перемешивая. При обра
зовании осадка или мути в пробирки добавляют по 1 см3 ацетона и перемешивают до полного их
исчезновения. В этом случае ацетон добавляют в контрольные пробирки «фона» реактивов по 4.5.2 и
«фона» субстрата по 4.5.3.
4.5.1.5 Содержимое пробирок доводят до общего объема 10 см3дистиллированной водой и изме
ряют оптическую плотность D, на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине световой
волны 610 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм против «фона» реактивов по4.5.2.
Значение оптической плотности должно быть вдиапазоне 0,8— 1.1.
4.5.1.6 Если значение оптической плотности опытной пробы Офнаходится за пределами рабочей
зоны градуировочного графика и не укладывается в диапазон ее значения, определение активности
следует повторить с рабочим раствором анализируемого образца, содержащим большее или меньшее
количество фермента соответственно.
4.5.2 Определение оптической плотности «фона» реактивов
Контрольным раствором при колориметрировании исследуемых растворов является «фон» реак
тивов. Против него производят замер оптической плотности опытной пробы Оф, «фона» субстрата Dcи
«фона» фермента 0 0. Контрольную пробу на реактивы осуществляют, внося в пробирку 0.5 см3ацетат
ного буферного раствора по 4.3.1, 0,5 см3дистиллированной воды и 1 см3реактива Шомоди по 4.3.2.
6