ГОСТ Р ИСО 10993-5—2009
8.4.1.9Осматривают клеткидля определения цитотоксичности до и после осторожного удаления
образцов с поверхности агара. Использование витальной окраски, например нейтрального красного,
может способствовать обнаружению цитотоксичности. Витальный краситель можно добавлять до или
после инкубации с образцом. Если краситель добавлен перед инкубацией, то культуры защищают от
воздействия света во избежание повреждения клеток вследствие фотоактивации витального
красителя.
8.4.2 Испытание методом диффузии на фильтре
8.4.2.1 Это исследование используютдля качественной оценки цитотоксичности.
8.4.2.2 Свободный от поверхностно-активных веществ фильтр с размером пор 0,45 мкм помеща
ют в каждый сосуд идобавляют определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной сус
пензии в каждый издостаточного числадублирующихсосудовдля испытания. Осторожным вращением
клетки равномерно распределяютпо поверхности каждогофильтра.
8.4.2.3 Культуры инкубируют при температуре (37 ±2) °С в воздухе в присутствии 5 % (доля объе
ма) двуокиси углеродаили без нее в соответствиисвыбраннойдля культуральной среды буфернойсис
темой до тех пор, пока культуры не вырастут приблизительно до конфлуэнтности в конце
логарифмической фазы кривой роста.
8.4.2.4 Перед началом исследования субкоифлуэнтность и морфологию культур проверяют с
помощью микроскопа.
8А2.5 Удаляют из сосудов культуральную среду. Затем фильтр стороной, на которой находятся
клетки, помещают на слой застывшегоагара (см. 8.4.1.6).
8.42.6 Осторожно помещают дублирующие исследуемые образцы на верхнюю (без клеток) сто
ронуфильтра. Жидкие экстракты исвежесмешанные смеси помещаютна фильтр.
8.4.2.7 Готовят дублирующие фильтры с препаратами отрицательного и положительного кон
трольныхобразцов.
8.4.2.8 Сосуды инкубируют в условиях, описанных в 8.4.2.3,в течение 2 ч »10 мин.
8.4.2.9 Осторожно удаляютобразцы сфильтра иотделяютфильтрот поверхности агара.
8.4.2.10 Определяют цитотоксичность, используя соответствующую методикуокрашивания.
8.5 Определение цитотоксичности
8.5.1Определяют цитотоксичность методом качественной или количественной оценки.
а) Качественная оценка: осматривают клетки через микроскоп, прижелании используя цитохими
ческую окраску, чтобы оценить изменения, например изменение общей морфологии, вакуолизацию,
расщепление, лизис клеток и целостность мембран. Отклонение от нормальной морфологии регистри
руютвотчетеобисследованииописательноили цифрами. В таблице 1приведенудобныйспособоценки
испытуемых материалов.
Т а б л и ц а 1
Шкала цитотоксичности
Интерпретация
0
Не цитотоксичный
1Легкая цитотоксичность
2Средняя цитотоксичность
3Значительная цитотоксичность
Описывают метод оценки в отчете. Метод и результаты оценкидолжны быть включены в отчетоб
исследовании.
Ь) Количественнаяоценка: измеряютчисло погибших клеток, замедление роста клеток, пролифе
рацию клеток или образование колоний. Число клеток, количество белка, высвобождение ферментов,
высвобождение или сокращение витальной окраски или другой измеримый параметр могут быть коли
чественнооценены с помощью объективныхсредств. Объективные средства ирезультатрегистрируют в
отчете об исследовании.
П р и м е ч а н и е — Для отдельных методов определения может потребоваться нулевое время или базовая
контрольная линия клеточной культуры.
8.5.2Необходимо убедиться в тщательности выбора методов исследования, так как результаты
исследования могут оказаться недействительными, если исследуемый образец выделяет вещества,
создающие помехи в тест-системе или в измерении.
6