ГОСТ Р ИСО 10993-5—2009
6 Культуральная среда
6.1 Культуральная средадолжна бытьстерильной.
6.2 Культуральнаясреда ссывороткой илибез нее должна соответствоватьусловиям, требовани
ям роста или поддержанияжизнеспособности определенной линии клеток.
П р и м е ч а н и е — Можно включить в состав среды антибиотики, убедившись, что они не оказывают небла
гоприятного воздействия на пробы.
Стабильность культуральной среды может различаться в зависимости от композиции и условий
хранения. Среду, содержащую сыворотку и глютамин, хранят при температуре от 2 °С до 8 °С не более 7
сут. Среду безсыворотки, содержащую глютамин, хранятпритемпературеот2еСдо 8 °Снеболеедвух
недель.
6.3 pH культуральных сред поддерживаютна уровнях 7.2 и 7.4.
7 Приготовление маточной клеточной культуры
7.1 Используя выбранную линию и культуральную среду, готовят достаточное число клеток для
проведения исследования. Есликлеткидолжны бытьвыращены изкультур, взятых изхранилища, необ
ходимо удалить криопротектор при его наличии. Перед использованием клеточную культуру пересева
ютхотя бы один раз.
7.2 Клетки удаляют ивновь приводят во взвешенное состояние путем ферментной и/или механи
ческойдезагрегации, используя наиболее подходящий методдля клеток каждойлинии.
8 Методы исследования
8.1 Числодублей
Для исследуемых проби контроля необходимо использовать не менее трехдублей.
8.2 Испытание экстрактов
8.2.1 Это испытание позволяетоценить цитотоксичность качественно и количественно.
8.2.2 Определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии капают в каж
дый издостаточногочисласосудовдляэкспонированиясэкстрактом. Равномернораспределяютклетки
по поверхности каждогососуда легким вращением.
8.2.3 Культуры инкубируют при температуре(37 ♦ 2)вС в воздухе в присутствии 5 % (доля объема)
двуокиси углерода или без нее в соответствии с выбраннойдля культуральной среды буферной систе
мой.
Исследование можно осуществлять на субконфлюэнтном монослое, клетки которого прикрепля
ются к какому-либотвердому субстрату, или на свежесуслендированныхклетках.
При оценкеобразования колонийследуетиспользоватьсоответственнонизкуюплотностьклеток.
8.2.4 Перед началом исследования субконфлуэнтность и морфологию культур проверяют с
помощью микроскопа.
8.2.5 Проводятисследование.
a) на исходном экстракте и
b
) серии разведений экстрактов, используя как разбавитель культуральную среду.
Если в исследовании используют монослой, то культуральную среду следуетудалить и добавить
кратное количествоэкстракта или его разведения в каждый из сосудов.
Если в исследовании используют суспензионные клетки, то добавляют экстракт или его разведе
ние в каждый издублирующих сосудовсразу же после приготовления клеточной суспензии.
8.2.6 Когда используютне изотоническийэкстракт, например воду, испытываютэкстракт при наи
более физиологически совместимой концентрации после разведения в культуральнойсреде.
П р и м е ч а н и е — Рекомендуется использовать концентрированную культуральную среду, например 2х,
5х. для разведения водных экстрактов.
8.2.7 Добавляют определенное количество пустого реактива, отрицательного и положительного
контрольныхобразцов в дополнительныедублирующие сосуды.
П р и м е ч а н и е — Контроль свежей культуральной среды при необходимости подвергают исследованию.
8.2.8 Сосуды инкубируют, используя условия, описанные в 8.2.3. в течение периода времени,
соответствующего специфическим условиям конкретной пробы.
4