ГОСТ Р 52174-2003
Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 27 мм3 (из расчета на одну
анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3—5 с на аппарате для встряхивания,
не допуская образования пены. Общий объем реакционной смеси для аыПЦР готовят с учетом числа
анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная
ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38).
6.3.1.2 Реакционную смесь для амПЦР, полученную по 6.3.1.1, осаждают кратковременным
(10—15 с) центрифугированием на настольной центрифуге при частоте вращения 1500—3000 мин*1
и сразу же используют для проведения анализа.
6.3.2 Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный, специально обученный пер
сонал всоответствии с требованиями |22|. Для проведения амПЦР допускается использовать только
стерильную лабораторную посуду и новые стерильные мнкроцеитрифужные пробирки. При прове
дении амПЦР каждую микроцеитрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесе
нием анализируемой пробы, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается
открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и
оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают мнкродозато-
ром с новым стерильным наконечником с фильтром.
7 Проведение анализа
7.1 Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР
7.1.1 Реакционную смесь для амПЦР. полученную по 6.3.1.2, микродозатором вносят в чистые
микроцентрнфужные пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 см’ по 27 мм5в каждую.
7.1.2 АнализируемуюДНК, выделенную по 6.2, вносят мнкродозатором по 3 мм3в микроцент
рнфужные пробирки с реакционной смесьюдля амПЦР по 7.1.1. При использовании амплификатора
ДНК по 4.3 |3| без подогрева крышки в каждую мнкроцентрнфужпую пробирку с реакционной
смесью вносят по 30 мм3вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси
от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в
результате чего образуются водная и масляная фазы.
7.1.3 В две другие микроцентрнфужные пробирки микродозатором вносят по 3 мм3 раствора
заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль) и раствора заведомо нетрансгенной ДНК
(отрицательный контроль).
7.1.4 Все микроцентрифужные пробирки со смесями, полученными по 7.1.2, и растворами,
подготовленными по 7.1.3. помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе,
указанной в таблице 2.
Т а б л и ц а 2 —Программа проведения амПЦР
Шах программы
Темпсрахура, "С
Время нмкуб,шин
Число циклов
1
1
2
37
3
95
95
62
72
72
5 МИН
30 с
30с
30с
5 мин
1
7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе
7.2.1 В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по
24 мм’ гибридизационного буфера, приготовленного по 6.1.4. Затем к гибридизационному буферу
добавляют по 12 мм’ водной фазы ПЦР-смесн. полученной в результате проведения амПЦР по
7.1.4, и перемешивают в течение 20—30 с на аппарате для встряхивания по 4.10 с частотой
вращения не
менее 1500 мин-1 для получения гибридизаиионпой смеси.
7.2.2 Из каждой микроцептрифужной пробирки микродозатором отбирают по 28 мм3 гибрн-
дизационной смеси (для каждого биологического мнкрочнпа), полученной по 7.2.1. и всю смесь
помещают на поверхность биологического микрочипа через отверстие в пластиковой крышке.
Гибридизацию проводят в термостате |4| при температуре 37 *С в течение 18 ч.
7