(Продолжение Изменения№ 2
к
ГОСТР 52174—2003)
6.2.2 Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по6.2.1. центрифугируют при ком
натной температуре в настольной центрифуге по 4.8 [4] при частоте вращения 13000 мин"’ в течение 10
мин.
6.2.3 Надосадочнуюжидкость, полученную по6.2.2, отбирают микродозатором (обычнопо 500 мм3)
ипереносят вчистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равныйобъем хлороформа поГОСТ20015.
Содержимое перемешиваютнааппаратедля встряхивания в течение 2 мин и центрифугируют 10мин при
частоте вращения 13000 мин"1.
6.2.4 Верхнюю жидкую фазу изсмеси, полученной по6.2.3, аккуратно отбирают микродозатором в
чистые микроцентрифужные пробирки, не захватывая промежуточную или нижнюю фазу. В пробирки до
бавляют два объема ЦТАБ-раствора. приготовленного no 6.1.7. аккуратно перемешивают, переворачивая
пробирки вручную, и выдерживают 60 мин при комнатной температуре.
6.2.5 Смесь, полученную по6.2.4, центрифугируют 5 мин причастотевращения 13000 мин’\ Надоса
дочнуюжидкостьтщательно удаляют микродозатором, а осадокрастворяют в 350—600 мм3(в зависимо
сти от объема осадка) разведенного раствора NaCI. приготовленного по 6.1.8, добавляют равный объем
хлороформа по ГОСТ 20015, перемешивают на аппаратедля встряхивания в течение 30 секи центрифу
гируют 10мин при частоте вращения 13000 мин1.
6.2.6Надосадочную жидкость, полученную по6.2.5, отбирают микродозатором ипереносят вчистые
микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем изопропиловогоспирта по4.27, аккуратно пере
мешивают содержимое пробирок вручную ивыдерживают в течение 1часа при комнатной температуре».
Подраздел 6.2дополнить пунктами 6.27—6.2.9:
«6.2.7 Смесь, полученную по6.2.6. центрифугируют 10мин причастоте вращения 13000 мин-’, надо
садочную жидкость аккуратно сливают, а к осадку ДНК добавляют 1 см370%-ного этилового спирта,
приготовленного по6.1.3 иохлажденногодо температуры 0 °С— 4 °С, перемешивают и центрифугируют 5
мин при частоте вращения 13000 мин ’.
6.2.8 Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают
при комнатной температуредо полного удаления этиловогоспирта, но неболее 30 мин.
6.2.9 ОсадокДНК, полученный по6.2.8. перерастворяютв40—50 мм3особочистой стерильной воды.
Полученный растворДНК используют для проведения амПЦР.
Срокхранения раствораДНК при температуре минус20 ЭС— до одного года».
Пункт 6.3.1.1 изложить в новой редакции.
«6.3.1.1 Готовят две микроцентрифужные пробирки вместимостью по 1.5 см3и маркируют их «М1»
и «М2».
В пробирку «М1» микродозатором вносят (из расчета накаждую анализируемую пробу): 2,5 мм310х
буфера реакционного для ПЦР по 4.32:2.5 мм3смеси дезоксирибонуклеоэидтрифосфатов по4.35 (14). 2
мм3фермента Taq-полимеразы по4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм3)*, 1мм3 флуоресцентного суб
страта ФС по 4.36 [15]. а также 1мм3водного раствора праймеров «ПР-1» по 4.40 [19].
В пробирку «М2» микродозатором вносят (из расчета накаждую анализируемую пробу): 2,5 мм310х
буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2.5 мм3 смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14]. 2
мм3фермента Taq-полимеразы по4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм3)*, 1мм3флуоресцентного суб
страта ФС по4.36 [15]. а также 1мм3 водного раствора праймеров «ПР-2» по4.41 [20].
Смесь разбавляют особочистой стерильной водой до объема 20 мм3 (израсчета на однуанализиру
емую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3—5 с на аппарате для встряхивания, не допуская
образования пены. Общий объем реакционных смесей в микропробирках «М1» и «М2»для амПЦР готовят с
учетом числа анализируемых проб идвух контрольныхпроб: положительный контроль (заведомотранс
генная ДНК по4.37) иотрицательный контроль (заведомо нетрансгеиная ДНК по4.38)».
Пункты 7.1.1—7.1.4 изложить в новой редакции; дополнить пунктами — 7.1.5, 7.1.6:
«7.1.1 Для каждой анализируемой пробы готовят 2чистые микроцентрифужные пробирки вместимос
тью 0,2 или 0.5 см3, маркируя их «N,» и «N2», где N— номер анализируемой пробы.
* Срок хранения Taq-попимеразы после разведения при температуре от 2 "С до 8 ‘С — не более 2 ч.
5