ГОСТ Р 52174-2003
ГОСТ 4233. растворяют в 70—80 см5 особо чистой стерильной волы, татем полученный раствор
переносят в мерную каабу вместимостью 100см’ и особо чистой стерильной водойдоводят до метки.
Срок храпения при комнатной температуре —не более одного года.
6.1.7 Приготовление раствора 20 %-ного додецилсульфата натрия (SDS) 112]
В стеклянную каабу вместимостью 100 см* помешают 20 г сухого долецилсульфата натрия по
4.27 и добавляют 80 см’ особо чистой стерильной волы. Растворяют при плавном перемешивании
на магнитной мешалке и одновременном нагревании до температуры 40 *С—50 *С до полного
растворения. Срок хранения при комнатной температуре —не более одного года.
6.1.8 Приготовление буфера экстракции
В мерной колбе вместимостью 50 см3смешивают 5 см3 раствора Трис-HCI. приготовленного
по 6.1.5. 5 см3 раствора NaCJ, приготовленного по 6.1.6. 1,25 см’ раствора 20 %-ного SDS, приго
товленного по 6.1.7, и 2,5 см3раствора ЭДТЛ. приготовленного по 6.1.2; каждый раствор
отбирают отдельной стеклянной пипеткой. Объем раствора доводят до 50 см* особо чистой
стерильной водой. Срок хранения при температуре 4 ‘С—5 *С —не более двух недель, в
морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 ’С —не более одного года.
6.1.9 Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус 20 "С не более одного
года. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 *С.
6.2Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)
6.2.1 Две навески каждого анализируемого продукта массой 60—80 мг помешают в две чистые
стерильные микроиентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1,5 см3, втечение 15—20с доводят
до состояния однородной смеси пестиком по ГОСТ 21400 при комнатной температуре и сразу
микродозатором добавляют по 400 мм’ буфера экстракции, приготовленного по 6.1.8.
6.2.2 Микроиентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, интенсивно встря
хивают в течение 5 с на аппарате для встряхивания по 4.10 |7|, быстро нагревают на водяной бане |19|
до температуры 65 *С и выдерживают при этой температуре 15—20 мин. периодически осто рожно
перемешивая содержимое.
6.2.3 Микроиентрифужные пробирки со смесыо, приготовленной по 6.2.2, центрифугируют
при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 |5) при частоте вращения 13000 мин-1
в течение 5 мин.
6.2.4 Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.3, отбирают по 300 мм3и переносят в чистые
микроцентрифужные пробирки, содержащие по 300 мм3 изопропилового спирта по ГОСТ 9805.
Содержимое перемешивают, выдерживают 5 мин при комнатной температуре и центрифугируют
5 мин при частоте вращения 13000 мин"1.
6.2.5 Надосадочную жидкость по 6.2.4 тщательно удаляют микродозатором, а осааок ДНК,
полученный по 6.2.4, промывают 1 см3 70 %-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и
охлажденного до температуры 0 *С—4 *С. центрифугируют аналогично 6.2.4. Полученную надоса
дочную жидкость вновь тщательноудаляют, аосадок ДНК подсушивают при комнатной
температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.
6.2.6 ОсадокДНК. полученный по 6.2.5, перерастворяют в 40—50 мм3особо чистой стерильной
воды. Полученный раствор ДНК используют;тля проведения амПЦР. Срок хранения раствора ДНК
при температуре минус 20 *С —не более одного года.
6.3 Подготовка асимметричной мультиплексной IIЦР
6.3.1 Приготовление реакционной смеси для амПЦР4
6.3.1.1 В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3 микродозатором вносят (из
расчета на каждую анализируемую пробу): 3 мм3 10х буфера реакционного для Г1ЦР по 4.32; 3 мм3
смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.36 |16|, 2,5 мм’ фермента Taq-полимеразы по 4.31
113] (концентрацией 5 Ед. акт/мм3)**, а также водный раствор праймеров по 4.40 1201 в следующих
концентрациях (нг/дм3):
35S_n/35S_o$ - 15,32/81,02;
£ых_п/#мз_оф —3,75/37,59;
лаг_п/яау_оф —3,61/84,74;
нрг_п/прг_оф —7,51/36,01;
ocs^n/ocsjkfr —8,18/41,41.
* Реакционную смесь дли амПЦР готовят непосредственно перед анализом при температуре нс выше
20 *С.
” Срок хранения Taq-поли.меразы после разведения при температуре от 2 ‘С до 8 "С —нс более 2 ч.
6