ГОСТ Р 52995—2008
7 Отбор проб
В лабораторию должна быть доставлена представительная проба. Она недолжна быть повреж
дена или изменена во время транспортирования и хранения.
Отборпробы рекомендуетсяпроводитьпо ГОСТ26809и[1].
8 Приготовление к испытанию
8.1 Содержание белка образца для испытания
Общеесодержаниебелкадляиспытанияопределяют, используяметоды, установленные в[2]и[3].
8.2 Приготовление пробы для испытания
Если содержание белка впробедля испытанияот30 %до40 % от массовой фракции, то взвешива
ют 126 мг испытуемой пробы с точностью до 0.1 мг в микрососуде с завинчивающейся крышкой. Если
содержание белка испытуемого образца выходит за пределы этого интервала, пропорционально меня
ютмассу образца.
В пробе для испытания в микрососуде добавляют 1 см3экстрагирующего буфера. Смешивают
полученныйрастворв вихревоймешалкесоскоростью 2500об/минвтечение 1.5 мин.Даютвыстоятьсяв
течение 5 мин. а затем перемешивают раствор снова в течение 1.5 мин. Центрифугируют смесь при
6500 g в течение 30 мин. С помощью пипетки Пастера осторожно удаляют надосадочную жидкость с
осадка.
Промываютосадокс помощью 1см3экстрагирующего буфера. Центрифугируют промытыйосадок
при 6500 g в течение 20 мин. С помощью пипетки Пастера осторожноудаляют надосадочную жидкость.
Еще раз промываютоставшийся осадок потойже методике.
К промытому осадку в микрососуде добавляют 250 см3буфера для образца. Закрывают сосуд и
нагреваютегопри температуре95 °С в течение 10 мин. перемешивая приэтомтермомиксером, который
установлен приблизительно на 1000 об/мин. Охлаждаютсосуд в холодной (ледяной) воде или на льду.
После охлаждения снова центрифугируют сосуд с его содержимым при 3000 g в течение 5 мин.
Переносят около 200 см3 чистой надосадочной жидкости в соответствующий сосуддля впрыскивания,
чтобы использовать в качестве испытуемого раствора.
После нагреванияобразец в микрососуде может также сохраняться в морозилке.
Вышеуказанный этап центрифугирования можно пропустить, если содержимое сосуда прозрачно
уже визуально.
9 Методика испытания
9.1 Условия функционирования
9.1.1 Рабочие условия для капиллярного электрофореза (СЕ)
Капиллярную колонку (см. 5.9.1)сохраняюттолькодлявыполненияданнойлабораторнойпроцеду
ры. Новую колонку промывают водой. Перед каждой сериейанализов использованный капиллярпромы
вают раствором едкого натра в течение 0.5 мин. а затем промывают электрофорезным буфером в
течение0.5 мин.
Перед каждым разделением вновь промывают колонку, предпочтительно в обратном направле
нии. электрофорезным буфером при 241325 Па в течение 1мин.
Миграциипроисходятпри температуре25 °С. Начинают электрофорез, когдаприборкапиллярного
электрофореза установлен на напряжение 2 кВ. затем следуетлинейный градиент напряжения от 2 до 7
кВ за 1,7 мин. Напряжение остается постоянным, равным 7кВ. до истечения периода общего времени
электрофореза 16 мин. Ток должен быть около 20 мкА. а прибор должен быть заземлен со стороны
инжектора. Настраиваютдетектор на 14 нм, сборданных при 2 Гц ивремя нарастания 0.5 с.
На основании характеристик прибора операторам следует адаптировать условия его функциони
рованиядля получения сравнимого качественногоразделения.
9.1.2 Впрыскивание
Испытуемый раствор впрыскивают под давлением 3447.5 Па в течение 60 с. Затем погружают
капилляр стороной впрыскивания в сосуд с водой на 6с. а затем впрыскиваютэлектрофорезный буфер
из электрофорезного сосуда под давлением 3447.5 Па в течение 5 с. После этого этапа проводят миг
рацию.
з