ГОСТ Р 51921-2002
пробирки с МПА с 1 % глюкозы и выдерживают в течение 24—30 ч при температуре (22 ± 1) °С в темном месте. Культуру, выращенную на МПА с 1 % глюкозы, смывают небольшим количеством физиологического раствора, чтобы получить густую взвесь (10—15 млрд. клеток в 1 см3).
Реакцию агглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах.
На предметное стекло наносят две капли: каплю поливалентной сыворотки и каплю физиологического раствора. К обеим каплям добавляют по одной капле смыва культуры, выращенной на МПА с 1 % глюкозы. Смесь тщательно и быстро перемешивают бактериологической петлей или запаянным концом пастеровской пипетки, после чего стекло плавно покачивают круговыми движениями. Одновременно ставят контрольный опыт: на предметное стекло наносят каплю поливалентной сыворотки и добавляют к ней каплю физиологического раствора.
Учет результатов реакции агглютинации проводят в течение 3 мин, отмечая появление хлопьев в капле с сывороткой. Запоздалые реакции не учитывают.
Реакцию агглютинации считают положительной при появлении хлопьев в капле с поливалентной листериозной сывороткой и отрицательной реакцией — отсутствие хлопьев в контроле.
При наличии спонтанной агглютинации реакцию агглютинации ставят повторно по указанной выше методике, но при посеве на МПА с 1 % глюкозы в качестве посевного материала используют культуру, выращенную в МПБ с 1 % глюкозы в течение 24 ч при температуре (22 ±1) °С, чтобы предотвратить повторную спонтанную агглютинацию.
7.5.5 Определение чувствительности Listeria monocytogenes к листерийному бактериофагу L-3A для идентификации.
Допускается дополнительное определение для идентификации Listeria monocytogenes по реакции чувствительности к листерийному бактериофагу L-3A.
Для определения используют агаровую культуру, выращенную по 7.3.3 при температуре (37 ± 1) °С в течение 16—18 ч, которую засевают в МПБ с 1 % глюкозы или МПБ с 0,5 % глюкозы. Количество посевного материала должно быть таким, чтобы после встряхивания в пробирке с бульоном образовалась легкая опалесценция. Культуры подращивают в термостате при температуре (37 ±1) °С в течение 4 ч. После этого бактериальную взвесь наносят газоном на поверхность подсушенного МПА в чашках Петри. При подсушивании чашки открывают и переворачивают вверх дном. Агар, разлитый накануне, подсушивают 20 — 30 мин при комнатной температуре, а разлитый в день исследования — 1—1,5 ч при температуре (37 ± 1) °С.
В одной чашке можно одновременно проводить анализ четырех культур. Для этого поверхность агара делят на четыре сектора. На каждый сектор наносят по 0,1 см3 исследуемой культуры и равномерно распределяют отдельным шпателем по отмеченному участку поверхности плотной питательной среды. Чашки с засеянными культурами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 1,0—1,5 ч.
Перед применением листерийного бактериофага L-3A содержимое ампул растворяют в пробирке, с МПБ, с 1% глюкозы в объеме, указанном на этикетке ампулы, и переносят в пробирки с соблюдением правил асептики. Растворенный бактериофаг не пригоден к использованию при наличии осадка, хлопьев или помутнения.
Неиспользованный в день исследования растворенный бактериофаг хранят в холодильнике при температуре 2—6 °С в течение 5—10 сут и применяют в дальнейшей работе после предварительной проверки на отсутствие бактериального загрязнения по [5].
Всю лабораторную посуду, в которой содержался бактериофаг, а также выбракованный бактериофаг и посевы после их учета обезвреживают кипячением не менее 30 мин.
Для исследования литического действия бактериофага на культуру листерий с целью ее идентификации на газон испытуемой культуры пастеровской пипеткой или бактериологической петлей наносят по одной капле бактериофага и отдельно каплю стерильного МПБ (контроль).
Место нанесения каждой капли отмечают карандашом по стеклу с наружной стороны чашки. Расстояние между наносимыми каплями должно быть не менее 1 см. Чашки после нанесения бактериофага и бульона оставляют при комнатной температуре (22 ± 1) °С в затемненном месте.
Учет результатов проводят через 16—24 ч. Культуру признают Listeria monocytogenes, если в месте нанесения бактериофага образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара. В месте нанесения капли стерильного бульона (контроль) зона лизиса должна отсутствовать.
7.5.6 Постановка реакции пассивной агглютинации для идентификации Listeria monocytogenes
Дополнительно для идентификации культуры, выращенной по 7.3.3, допускается использовать
9