ГОСТ 34104—2017
p
8.9 Вкаждую пробиркуотдельным наконечником добавляют по25 мм3 сорбента, предварительно
помещенного во встряхивательдля получения однородной суспензии. Содержимое пробирок переме
шивают на встряхивателе и инкубируют при комнатной температуре в течение 10—15 мин. перемеши
вая через каждые 2 мин. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с.
Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный
наконечникдля каждой пробы.
8.10 В пробиркидобавляют по300 мм3растворадляотмывки№ 1.Перемешиваютна встряхивате
ледо полного ресуспендирования сорбента. Сорбент осаждают центрифугированием при 5тыс. об/мин в
течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловуш кой
иотдельный наконечникдля каждой пробы.
8.11 Процедуру отмывки повторяютдважды, используя по 500 мм3раствора для отмывки N 2. и
центрифугируют втечение 30 с при 7 тыс. об/мин, удаляютнадосадочную жидкость полностью.
8.12 Пробиркисотмытым сорбентом помещают втермостатпри температуре 64 °С на 10 мин для
подсушивания сорбента. При этом крышки пробирокдолжны бытьоткрыты.
8.13 В пробиркидобавляютпо50 мм3буферадля элюцииДНК иперемешиваютна встряхивателе.
Помещают втермостатпри температуре64 °С на 5мин и периодически (один раз в минуту)встряхивают
на встряхивателе. Пробирки центрифугируют при 12тыс. об/мин в течение 1мин.
8.14 Надосадочнаяжидкостьсодержит очищеннуюДНК, которуюзатемиспользуютдля постанов
ки ПЦР и проведения амплификации. Очищенную ДНК можно хранить в течениеодной недели при тем
пературеот 2 °С до8 °С и втечениегода при температуреневышеминус 16 °С. Для этогорекомендуется
перенести надосадочную жидкость в чистую микропробирку.
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-
флуоресцентнойдетекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)
9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смоси
Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения генетически модифицированной
линиисои, кукурузы или рапсаберут 1мм3деионизированной воды, по 1мм3 каждогосоответствующего
праймерас маркировкой «F» по5.3.2 концентрацией5 • 10‘6моль/дм3,по 1мм3каждого праймерасмар
кировкой «R» по 5.3.2 концентрацией 5-10-8 моль/дм3. по 1 мм3каждого зонда с маркировкой «Р» по
5.3.2 концентрацией 3 -10-6 моль/дм3, 3 мм3 раствора дНТФ и смешивают в пробирке вместимостью
1,5см3. Срокхранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 X — не более 12 мес.
9.2 Постановка ПЦР
9.2.1 ДНК. экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испыты
вают не менее чем в двух повторностях.
9.2.2 Для проведения ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм3 ПЦР-смеси по 9.1, к которой
добавляют 5 мм3ПЦР-буфера и 0.5 мм3термостабильной Taq полимеразы. Смесь перемешивают на
встряхивателе. осаждая кратковременным центрифугированием.
9.2.3 Вносят по 15мм3смеси, полученной по9.2.2, в микропробиркувместимостью 0,2 см3, затем,
используянаконечникеаэрозольным барьером, добавляютв нее 10мм3ДНК. полученнойизанализиру
емой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общийобъем реакционной смеси — 25 мм3.
П р и м е ч а н и е — Необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
9.3 Контрольные реакции амплификации:
- отрицательный контроль ПЦР (К-) — вместоДНК-пробы в микропробиркус 15мм3смеси по9.2.2
вносят 10 мм3ТЕ-буфера;
- положительныйконтрольПЦР (К+) — вместоДНК-пробы вмикропробиркус15мм3смесипо9.2.2
вносят 10 мм31%-ного стандартного образца состава ГМ сои. ГМ кукурузы или ГМ рапса.
9.4 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Программируют прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального вре
мени в соответствии с инструкцией поэксплуатации.
Программы амплификации для идентификации линий ГМ сои, кукурузы и рапса различаются для
разных ГМлиний и приведены в таблицах4—11.
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий 40-3-2, А5547-127, А2704-12 приве
дена в таблице 4.
13