ГОСТ 34104—2017
6 Сущность метода
6.1 Сущность метода идентификации ГМлиний сои. кукурузы и рапса методом ПЦР с гибридиза-
ционно-флуоресцеитнойдетекцией врежимереальноговремени (Real Time PCR) заключается в прове
дении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов,
меченныхфлуоресцентными красителями, сцелью выявленияучастка видоспецифичнойДНК растений
(сои, кукурузы или рапса)ичастигенно-инженерной конструкции, специфичнойдля генома тестируемой
генетически модифицированной линии.
6.2 Методсостоит из следующихэтапов:
- экстракция и очистка ДНК: на данном этапе осуществляется лизис клеток с последующей очис
ткой ДНКот балластныхвеществ (белков, полисахаридов и других соединений);
- ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов, меченных флуоресцентным краси
телем. На данном этапе осуществляется накопление копий целевого участка ДНК идетекция ПЦР-про-
дуктов в режиме «реальноговремени»;
- анализ иинтерпретация результатов происходит наосновании наличия (или отсутствия)пересе
чения кривой флюоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на гра
фике зависимости интенсивности флюоресценции от количества циклов, что соответствует значениям
порогового цикла Ct.
7 Отбор проб
Общие правила отбора пробдля испытанийдолжны соблюдаться в соответствии с требованиями
ГОСТ ISO 6497.
8 Экстракция ДНК
8.1 Экстракцию ДНК изанализируемой пробыосуществляютс использованием набора реагентов
для экстракцииДНКсорбционным методом по5.3 или иным методом, позволяющим получитьдостаточ
ный объемДНКдля последующихисследований. ОбъемДНК. необходимыйдля проведенияисследова
ний. вычисляют поформулам:
Уи= 10 N,(1)
где Ум— объем ДНК. необходимыйдля проведения идентификации линий:
N — количество идентифицируемыхлиний:
1/к =10-2N.(2)
где Ук — объем ДНК. необходимыйдля проведения количественного анализа.
8.2 Буфердля лизирующего реагента и раствордля отмывки № 1(если они хранились при темпе
ратуреот2 “Сдо 8 °С) прогреваютна поверхности твердотельного термостата при температуре от60 °С
до 64 °С до полного растворения кристаллов.
8.3 Отбирают необходимое количествоодноразовых пробирокобъемом 1.5см3 (включая отрица
тельный контроль выделения). В пробирки вносят анализируемые пробы. В пробирку отрицательного
контроля выделенияДНК вносят 100 мм3 ОКО.
8.4 Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером вносят в каждую пробирку по 400 мм3
буфера для лизирующего реагента и по 17 мм3 лизирующего реагента. Тщательно перемешивают
содержимое пробирок на встряхивателе втечение 10с.
8.5 Пробирки инкубируют в термостате при температуре 64 °С в течение 1ч. периодически встря
хивая на встряхивателе (пять разчерез каждые 10—12мин).
8.6 Нерастворенные частицы анализируемой пробы осаждают центрифугированием при
12—14 тыс. об/мин в течение 5мин.
8.7 Надосадочную жидкость в объеме 200—350 мм3 очень аккуратно (так. чтобы не попали взве
шенные частицы и капли жира) отбирают отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и
переносят в новые пробирки.
8.8 Пробирки с надосадочнойжидкостью прогреваютв течение 5мин втермостате при температу
ре 64 °С, перемешивают содержимое пробирок и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об/мин для
сброса капельс крышки пробирки.
12