ГОСТ ISO 20838—2014
7.2 Обнаружение и/или подтверждение продуктов PCR
Продукты PCR могут быть обнаружены электрофорезом в геле или соответствующим альтер
нативным средством. Размер продуктов PCR может быть определен в сравнении с продуктами PCR
положительного контроля или с подходящей стандартнойдлиной ДНК.
ДляанализаPCRв реальном времени, обнаружение происходитодновременносамплификацией.
Для подтверждения идентичности продукта PCR применяются следующие методы, кроме опре
деления размера:
a) секвенированием ДНК продукта PCR;
b
) гибридизация продукта PCR со специфическимиДНК-зондами;
c) проведение рестрикционного анализа продуктов PCR: длина фрагментов после рестрикции
должна соответствовать ожидаемойдлине последовательностиДНК - мишени после рестрикции.
Положительный результат может быть подтвержден при помощи стандартизированного метода
микробиологического исследования культур или подтверждающих методов, описанных в соответству
ющихмеждународныхстандартах.
7.3 Методы контроля
Качество, целостность и количество ДНК-матрицы влияют на результаты PCR. икак следствие на
аналитические результаты.
Риск получения ложных положительных и/или ложных отрицательных результатов в процессе
PCR должен включать соответствующие методы контроля. Частота использования должна быть опре
делена как часть лабораторной программы гарантии качества. Внутренний или внешний контроль
амплификации должен использоваться в каждом процессе PCR.
Могутприменятьсясоответствующие справочныематериалы иссылкив культурныхсправочниках
на качественные положительные или качественныеотрицательные методы контроля.
7.4 Общие требования для реакций амплификации
Условия реакции и условия термоцикпирования должны быть оптимизированы для каждой пары
праймеров и/или системы. Когда любой PCR используется впервые на экстракте или суспензии, полу
ченной изособой матрицы, необходимо продемонстрировать, что условия реакции подходят длядости
жения необходимого предела обнаружения. Предел обнаружения в PCR минимального количества
ДНК-мишени должен получить сигнал. При оптимальной реакции требуются менее 40 циклов для
амплификации целевых молекул, чтобы произвести продукт, который обнаруживается с помощью
стандартных методов.
Специфика реакции должна быть улучшена в максимально возможной степени, например, при
помощи PCRсиспользованием горячегостарта. Горячийстартповышаетспецификупутемуменьшения
побочных реакций, таких как амплификация нецелевых последовательностей во второстепенной ДНК
(ошибочное праймирование) иолигомеризация праймеров.
7.5 Аспекты конструирования праймеров
При сравнении производительности конкретной PCR с производительностьюдругой PCR следует
учитыватьаспекты конструирования праймеров.
Последовательности праймеровдолжны иметь следующиехарактеристики:
a) длина каждого праймерадолжна составлятьот 18 до 30 нуклеотидов;
b
) соотношение GC:AT должно быть 50:50, если это возможно, или максимально близко к этому
отношению:
c) отсутствие концентрации Gs и Cs в коротких сегментах праймеров (высокая внутренняя
стабильность);
d) отсутствие комплементарного 3‘конца во избежание формированиядимеров праймера:
в) отсутствие внутренней вторичной структуры;
f) отсутствие возможного формированиядимеров праймера или проб, используемых в PCR.
Доступен пакет программ в помощь при конструировании праймеров.
7.6 Проверка специфики праймеров
7.6.1 Общие положения
Способность праймеров к обнаружению целевой последовательности должна быть подтверж
дена.
Используется два шага для подтверждения: первый шаг — теоретическая оценка, и второй —
эмпирическая оценка.
4