ГОСТ ISO 20838—2014
5.9.3 Ингибиторы РНКазы (рибонуклеазы)
В PCR в реальном времени ингибиторы используютсядля предотвращения разложения продукта,
которогомогут загрязнитьреактивы или пластмассовую посуду, используемую впроцедуреизвлечения.
5.9.4 Реагентыдля предотвращения переноса продуктов PCR
Дальнейшая мера против загрязнений — системадезинфекции (например, на основе псоралена,
dUTP иUNG) может бытьвключенавсистему PCR. чтобы минимизироватьрискпереносазагрязненийот
продуктов PCR. произведенных во время предыдущих реакций.
6 Аппараты и оборудование
Аппараты и оборудование должны соответствовать ISO22174.
В дополнение к стандартному лабораторному оборудованию используют следующие аппараты и
оборудование.
6.1 Термоциклеры
Термоциклеры должны точно воспроизводить температуру и время цикла, описанные в методе
PCR.
6.2 Пипетки с фильтрами
Требуютсятри набора пипеток, пооднойдля каждого процесса:
- подготовки проб.
- подготовки мастермикса.
- пост-амплификации.
П р и м е ч а н и е — Использование пипеток с фильтрами не обязательно в пост-амплификации.
6.3 Сосуды для реакций
Сосуды для реакций должны быть пригодны для использования 8 термоциклерах, и быть устой
чивы к неоднократным нагреваниям до 100 вС иохлаждаться без повреждениядо 4 °С.
6.4 Система обнаружения продуктов PCR
Система обнаружения продуктов PCR. включает:
a) аппарат для агарозы или электрофореза в полиакриламидном геле и. при необходимости,
ультрафиолетовый радиационный источник для того, чтобы сделать запись визуализации амплифи-
цированной ДНК, или
b
) аппарат для колоночной хроматографии нуклеиновых кислот и соответствующей системы
обнаружения, или
c) твердые фазы, загруженныеспециальными зондамидля обнаружения продуктов PCR, или
d) другие подходящие системы.
7 Процедура
7.1 PCR-амплификация
Амплификация определенных нуклеотидных последовательностей может произойти в пробирке
во время реакции, катализируемой к ДНК-полимеразой в присутствии олигонуклеотидных праймеров и
дезоксирибонуклеоэидтрифосфатов в определенных буферах реакции. Важным условием для ампли
фикации целевой последовательности является отсутствие ингибирования ДНК-полимеразы в реак
ции. АмплификацияДНК-циклический процесс, состоящий:
a) из денатурации двухспиральной ДНК в одноцепочную нуклеиновую кислоту посредством
нагревания;
b
) отжига олигонуклеотидных праймеров с комплементарной целевой последовательностью на
обоих концаходной нитиДНК. при подходящей температуре:
c) удлинения праймеров с дезоксирибонуклеозидтрифосфатами на ДНК-полимеразе при под
ходящей температуре.
РНК может быть обнаружена использованием PCR. если последовательность была сначала
транскрибирована в комплементарную последовательностьДНК обратной транскриптазой.
з