ГОСТ 33835—2016
анализируемой пробы в кювете, компенсируя снижение общего объема в кюветеувеличением объема
дистиллированной воды.
Если массовая концентрация лимонной кислоты в растворе анализируемой пробы менее
0.00002 г/см3.то ее объем, вносимый в кювету, может быть увеличен до 2.00 см3. В этом случае сле
дует снизить на соответствующее значение объем дистиллированной воды, добавляемой в кювету,
для поддержания на постоянном уровне общего объема инкубационной смеси в кювете.
При вычислении результатов необходимо учесть измененный объем раствора определяемой
пробы в формуле (5).
8.3 К подготовленному в кювете по 8.2 раствору добавляют 0.02 см3раствора ЦЛ. Содержимое
кюветы перемешивают. Через 5—10 минизмеряют оптическую плотность (AjJhpoea раствора. Окончание
реакции проверяют путем повторного считывания показаний спектрофотометрачерез 2 мин. Реакция
считается завершенной при максимальном отклонении результата повторного считывания показаний
спектрофотометра с результатом измерения оптической плотности (Дг)про6а в пределах ± 0,002 еди
ниц оптической плотности. Если данное условие не выполняется, то определение повторяют по 8.1.
8.4 Контрольное определение
В кювету вносят 1.00 см3 буферного раствора 7.8 ед. pH. 0.1 см3 раствора НАДН. 2.00 см3воды
и 0.02 см3суспензии ферментов МДГ/ЛДГ. содержимое перемешивают. Через 5 мин измеряют на
чальную оптическую плотность раствора (А ,),^^,..
К подготовленному в кювете раствору добавляют 0.02 см3ЦЛ. перемешивают, выдерживают в
течение 5— 10 мин и измеряют оптическую плотность
(А2).
оит
р
оп
».-
9 Обработка и оформление результатов определения
Основой для вычисления результатов определения является линейная зависимость между
количеством окисленного НАДН и количеством лимонной кислоты.
Разность измеренных значений оптических плотностей ДА вычисляют по формуле
э
о
ДА - [(А])пр0еа —(А2)П(>
0
] —[(Ai Хяитроль “ (А2Х(Оитроли1>(4)
где (AiJn^oa - (А2)проВа— разница значений оптических плотностей А, и А2в кювете с пробой;
(A,),o«Tponh - {АДоитрогч. — разница значений оптических плотностей А, и А2в кювете с контрольным
определением.
Если (A,).0MTpanii>- (Az)lcwIt>onii имеет отрицательное значение, то его суммируют со значением
(Ai)npo6a — (Аг^рова
ДА - [(AfJnpoto—(А2)П(>:,0а] + C(^i
XtOMTpont.
—(A2),o*Tpanw]-(5)
Значение ДА должно составлять не менее 0.100 ед. Если значение ДА менее 0,05 единиц, то
следует повторно приготовить пробу, увеличив ее навеску или уменьшив разбавление.
Если значение (А,)про6а- ( А ^ ^ более 1.000 ед. (измерение при 340 или 334 нм) или более
0.500 ед. (измерении при 365 нм), то в пробе присутствует избыток лимонной кислоты. В этом случае
пробу необходимо разбавить в соответствии с требованиями 6.2.
Массовую концентрацию лимонной кислоты в пробе С. г/дм3, вычисляют по формуле
„ _
м
- V,- F- ДА
°E-/-VV1000
(
6
)
гдеМ— молярная масса лимонной кислоты (безводная форма). 192,1 г/моль;
V, — суммарный объем раствора в кювете, см3;
F — фактор разбавления пробы, вычисляемый как отношение объема разведенной пробы к
объему, взятому для разбавления:
ДА — разница оптических плотностей, вычисляемая по формуле (4);
е— молярный коэффициент оптической плотности НАДН. при 340 нм— 6.3дм3•ммоль’ ’ см’1,
при 365 нм — 3,4 дм3-ммоль‘1•см-’1(ртутная лампа), при 334 нм — 6.18 дм3ммоль*1 см’1
(ртутная лампа);
/ — рабочая длина кюветы, см;
V2 — использованный объем раствора определяемой пробы, см3.
5