ГОСТ 32638—2014
Окончание
Условия метаболической
активации
ПокусХимическое вещество и CAS No
Присутствие экзогенной
HPRT
метаболической
активации
3-метилхолантрен (CAS No. 56-49-5)
N-нитрозодиметиламин (CAS No. 62-75-9)
7,12-диметилбензантрацен (CAS No. 57-97-6)
ТК (малые или большие колонии)
Циклофосфамид (моногидрат)
(CAS No. 50-18-0 (6055-19-2))
Бензо(а)лирен (CAS No. 50-32-8)
3-метилхолантрен (CAS No. 56-49-5)
XPRT
N-нитрозодиметиламин (для высоких
уровней S-9 (CAS No. 62-75-9)
Бензо(а)лирен (CAS No. 50-32-8)
Возможно использование других положительных контролей. Например, если лаборатория имеет
накопленные данные по 5-бром- 2-деэоксиуридину [CAS № 59-14-3), то это соединение может быть ис
пользовано как положительный контроль. При необходимости допустимо использовать химические ве
щества того же класса, что и известные позитивные контроли.
Отрицательный контроль — растворитель или разбавитель в культуральной среде. Обработка
культуры проводится так же. как вэкспериментальных группах. Дополнительновводится контроль «куль
тура без обработки», пока накопленные (исторический контроль) в лаборатории данные не покажут от
сутствие вредного или мутагенного эффекта выбранного растворителя.
4.3 Проведение теста
4.3.1 Обработка культуры
Пролифирирующие клеткиобрабатывают веществом в условиях без ив присутствии метаболичес
кой активации. Длительность воздействиядолжна быть оптимальной (обычно эффективна от 3до 6 ча
сов). Время экспозиции может охватывать один или более клеточных циклов.
Для каждой концентрации могут использоваться либо две, либо одна культура. При использовании
одной культуры числоконцентраций следует увеличить, чтобы было адекватное число культур для анали за
(т. е. по крайней мере 8 концентраций). Необходимо ставить 2 культуры с отрицательным контролем.
Тестирование газообразных или летучих соединений следует проводить, используя адекватные
методики, такие как герметически закрытые культуральные флаконы (22. 23].
4.3.2 Оценка выживаемости, жизнеспособности и частоты мутаций
После окончания воздействия клетки отмывают и культивируют для оценки выживаемости и для
экспрессии мутантного фенотипа. Оценку цитотоксичности, определяя относительную эффективность
клонирования (выживаемость) и относительный общий рост культуры, обычно проводят после периода
воздействия.
Для каждого локуса имеется определенный период времени, необходимый для оптимальной экс
прессии фенотипа вновь индуцированных мутаций (мутантов) (для HPRT и XPRT необходимо по край
ней мере 6—8 дней, для ТК — 2 дня). Клетки выращивают в среде в присутствии и без селективного
агента для определения соответственно числа мутантов и эффективности клонирования. Оценку выжи
ваемости (используемую для расчета частоты мутантов) проводят по окончании времени экспрессии,
высевая клетки на неселективную среду.
Если вещество позитивно в ТК+/-тесте на клетках L5178Y. определяют размер колоний по крайней
мере на одной экспериментальной культуре (наивысшая позитивная концентрация) ина культурах отри
цательного и позитивного контроля. Если веществодало отрицательный результат в ТК+/- тесте на клет
ках L5178Y. размер колоний определяют в культурах отрицательного и позитивного контроля. В
исследованиях на ТК6ТК+/- также может проводиться анализ размера колоний.
5 Результаты и отчет
5.1 Обработка результатов
Данные должны включать цитотоксичность и выживаемость клеток, подсчет колоний и частоту му
таций для экспериментальных и контрольных культур. В случае положительного ответа в тесте ТК+/- на
клетках L5178Y, колонии измеряют, используя критерии отнесения колоний к малым ибольшим, покрай-
4