ГОСТ 32638—2014
дриальную фракцию в концентрации в диапазоне 1—10 % от конечного объема среды. Выбор и условия
системы метаболической активации зависят от класса исследуемого химического вещества. В некото
рых случаях возможно проведение опыта с более чем одной концентрацией постмитохондриальной
фракции. Ряд методик, основанных на использовании генноинженерных клеточных линий, экспрессиру
ющих специфические активирующие клеточные ферменты, могут обладать эндогенной активацией.
Выбор клеточных линий должен быть научно обоснован (например, присутствие изозима цитохрома
Р450. метаболизирующего исследуемое вещество).
4.1.5 Исследуемое вещество/подготовка
Твердые вещества следует растворятьили суспендировать в соответствующих растворителях или
разбавителях и раствор готовить перед обработкой клеток. Жидкие вещества можнодобавлять прямо в
культуру и/или разводить перед введением. Свежие препараты должны использоваться до тех пор. пока
не будут получены данные об их стабильности при соответствующих условиях хранения.
4.2 Условия тестирования
4.2.1 Растворитель/разбавитель
Растворитель/разбавитель не должен химически взаимодействовать с исследуемым веществом и
не должен влиять на выживаемость клеток и активность S9 системы. Если используется неизвестный
растворитель, его применениедолжнобыть обоснованоданными, показывающими егосовместимостьс
данным тестом. Рекомендуется, если возможно, использовать в первую очередь водные растворы/сус-
пензии. При исследовании нерастворимых в воде веществ используют органические растворители, не
содержащие воды. Вода может быть удалена с помощью молекулярного сита.
4.2.2 Воздействующие концентрации
Основными критериями при выборе максимальной концентрации вещества являются цитотоксич
ность, растворимость в тест-системе, изменение pH или осмотической концентрации.
Цитотоксичность должна быть определена в вариантах в присутствии и без метаболической акти
вации в основном эксперименте, используя в качестве показателей эффективность клонирования (вы
живаемость) или относительный общий рост. Полезно определить цитотоксичность и растворимость в
предварительном эксперименте.
Следует использовать по крайней мере 4 информативных концентрации. При наличии цитотоксич ности
концентрации должны быть вдиапазоне от максимальнойдо минимальной по токсичности или до
отсутствия токсичности. Обычноуровни концентрацийдолжны различаться в диапазоне от 2 раз до -Ло.
Если максимальная концентрация основана на цитотоксичности, то она должна давать приблизительно
10—20 % (но не меньше 10 %) уровень относительной выживаемости (относительной эффективности
клонирования) или относительного общего роста. Для нецитотоксичных веществ максимальные
концентрации следует брать 5 мг/мл, 5 мкл/мл или 0.01М. выбирая наименьшую.
Относительно нерастворимые вещества следует тестировать на уровнях выше или ниже границы
их растворимости в культуральных условиях. Данные по растворимости следует определять на культу
ральной среде, в которой обрабатывают клетки. Полезно оценить растворимость в начале и в конце об
работки. так как растворимостьможет меняться во время обработки клеток из-за присутствия клеток, S9.
сыворотки и т. д. Нерастворимость можно определять на глаз. Преципитат не должен мешать анализу
результатов.
4.2.3 Контроли
Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель или разбавитель) контроли в
вариантах без и в присутствии системы метаболической активации должны быть включены в каждый
эксперимент. В варианте с метаболической активацией используемое в качестве положительного кон
троля вещество должно дать мутагенный ответ при данной системе метаболической активации.
Примеры положительных контролей
Условия ыетаболической
активации
Локус
Химическое вещество и CAS No
Отсутствие экзогенной
метаболической
активации
HPRT
Этилыетансульфонат (CAS No. 62-50-0)
Этилнитрозомочевина (CAS No. 759-73-9]
ТК (малые или большие колонии)
Метилметансульфонат (CAS No. 66-27-3)
XPRT
Этилметансульфонат [CAS No. 62-50-0)
Этилнитрозомочевина (CAS No. 759-73-9)
3