ГОСТ 32638—2014
3 Принцип исследования
Клетки, дефицитные по тимидинкиназе (ТК) вследствие мутации ТК+ -> ТК-, резистентны к цито
токсическому эффекту пиримидинового аналога трифтортимидина (ТФТ). Клетки, профицитные по ти
мидинкиназе. чувствительны к ТФТ, который вызывает ингибицию клеточного метаболизма и
останавливает клеточноеделение. Только мутантные клетки способны пролиферировать в присутствии
ТФТ. в то время как содержащие тимидинкиназу нормальные клетки не пролиферируют. Аналогично
клетки, дефицитные no HPRT или XPRT, отбираются по резистентности к 6-тиогуанину (ТГ) или8-азагуа-
нину (АГ). При тестировании генных мутаций in vitro следует тщательно анализировать особенности ис
следуемых веществ, не являются ли они аналогами оснований или соединениями, связанными с
селективными агентами, используемыми в данной тест-системе. Например, любая ожидаемая селек
тивная токсичность исследуемого соединения должна изучаться для мутантных и немутантных клеток.
Приемлемость отбора система/агент должна быть подтверждена, когда исследуемое соединение по
химической структуре связано с селективным агентом.
Клеточная суспензия или клеточный монослой подвергаются воздействию исследуемого соедине
ния как в варианте с, так и без метаболической активации в течение адекватного интервала времени и
затем субкультивируется для определения цитотоксичности и фенотипической экспрессии до отбора
мутантов [10,11.12.13.14]. Цитотоксичность обычно оценивается посоотношению эффективности кло
нирования (выживаемости) или по соотношению общего роста культур после воздействия. Обработан
ные культуры содержат в культуральной среде необходимый период времени, характерныйдля каждого
селективного локуса и клеточного типа, чтобы проявилась близкая к оптимальной фенотипическая
экс прессия индуцированных мутаций. Частота мутаций определяется путем посева определенного
числа клеток в содержащую селективный агент культуральнуюсредудля выявления мутантных клеток и
в сре ду без селективного агента для определения эффективности клонирования (выживаемости).
После соответствующего времени инкубации подсчитывают колонии. Частота мутаций определяется
из числа колоний в селективной среде и числа колоний в неселективной среде.
4 Описание метода
4.1 Материалы
4.1.1 Клетки
В тесте используются различные типы клеток, включая субклоны клеток L5178Y. СНО, AS52. V79
или ТК6. Используемые клетки должны быть чувствительны к химическим мутагенам, иметь высокую
эффективность клонирования и стабильный уровень спонтанных мутаций. Клетки необходимо
прове рять на загрязнение микоплазмой. Клетки не должны использоваться при наличии загрязнения.
Предварительно должна быть определена чувствительность и сила теста. Число клеток, количес
тво культур, концентрации исследуемого вещества должны отвечать этим параметрам [15]. Минималь
ное число выживших после обработки клеток, используемое на каждой стадии теста, должно
основываться на спонтанной частоте мутаций. Общее правило — использовать то количество
клеток, которое по крайней мере в 10 раз выше спонтанной частоты мутаций. Рекомендуется
использовать по крайней мере 106 клеток. Следует учитывать адекватные исторические данные по
клеточной системе, чтобы контролировать стабильность теста.
4.1.2 Среда и условия культивирования
Необходимо использовать соответствующую культуральную среду и условия инкубации (культу
ральная посуда, температура, концентрация С02и влажность). Культуральную среду выбирают в соот
ветствии с используемым в тесте типом клеток и селективной системой. Особенно важно, чтобы
выбранные условия культивирования обеспечивали оптимальный рост клеток в течение периода экс
прессии и оптимальную колониеобразующую способность как мутантных, так и немутантных клеток.
4.1.3 Приготовление культур
Клетки берут из сток культуры, высевают в культуральную среду и инкубируют при 37 °С. Перед ис
пользованием в тесте культуры необходимо очистить от предсуществующих мутантных клеток.
4.1.4 Метаболическая активация
Исследуемое вещество тестируют в культуре в вариантах без и в присутствии системы метаболи
ческой активации. Наиболее часто используемая система включает кофакторы и постмитохондриаль
ную фракцию (S9) печени грызунов, обработанных индукторами ферментов, такими как Arochlor [16.17. 18.
19] или комбинация фенобарбитала и р-нафтофлавоиа [20. 21]. Обычно используют постмитохон-
2