ГОСТ 31664—2012
Приложение А
(обязательное)
Приготовление липазы и проверка ео активности
А.1 Приготовление липазы
Охлаждают 5 кг свежей свиной поджелудочной железы до 0 °С. Удаляют твердый жир и соединительную
ткань, ее окружающую,иизмельчаютжелезудо полученияжидкой пасты. Перемешиваютэтупастус2.5дм3безвод
ногоацетона в течение 4—6ч на холоде изатем центрифугируют. Экстрагируют остатокеще трижды таким же объе
мом ацетона; дважды — смесью ацетона и этилового эфира в соотношении 1 .1 по объему и дважды — этиловым
эфиром. Высушивают остаток в течение 48 ч под вакуумом до образования порошка. Порошок хранят в
холодильнике.
А.2 Проверка активности липазы
Готовят масляную эмульсию, встряхивая смесь 165см3гуммиарабика концентрации 100 г/дм3.15 г дроблено
го льда и 20 см3 предварительно нейтрализованной пробы в течение 10 мин на пригодном для этой цели миксере.
Наливают последовательно 10 см3 эмульсии. 0.3 см3раствора холата натрия (200 г/дм3) и 20 см3 дистиллирован
ной воды в стакан вместимостью 50 см3. Помещают стакан в водяную баню при 37 ‘С (см. примечание 1). В стакан
опускают электроды pH-метра и пропеллерную мешалку и. используя бюретку вместимостью 5 см3, приливают по
каплям раствор гидроокиси натрия с (NaOH) в 0.1 моль/дм3 до тех пор. пока не будет достигнуто значение pH 8.5.
Приливают соответствующий (см. примечание 2) и точно отмеренный объем 0.1 %-ной водной суспензии анализи
руемого порошка липазы. Кактолько pH достигнет значения 8.3 по шкале pH-метра, включаютсекундомер и добав
ляют раствор NaOH так. чтобы значение pH 8.3 сохранялось. Записывают объем раствора щелочи, приливаемого
каждую минуту в течение 10 мин. Наносят полученные данные на график, откладывая на оси X время в минутах и на
оси /объем в сантиметрах кубических раствора щелочи, использованного для поддержания постоянного значения
pH. Результат должен выражаться в виде прямой линии.
П р и м е ч а н и я
1 Когда используют жидкое масло, гидролиз проводят при 37 "С. Однако для испытания устанавливают тем
пературу40 ‘С. позволяющую проанализироватьжиры, имеющие температуруплавления до 45 *С.
2 Для испытания образцов используют такое количество суспензии липазы, при котором потребляется 1см3
раствора щелочи за 4—5мин. Такой результат обычнодостигается при использовании 2см3—5см3суспензии липа
зы, то есть от 1до 5 мг порошка.
Единица липазы определяется как количество энзима, которое требуется для высвобождения 1мкмоль кис
лоты в минуту при 37 *С и pH 8.3.
Активность липазы А. выраженную в единицах липазы на миллиграмм использованного порошка, определя
ют по формуле
А . —<А-’ >
т
где V — объем израсходованного раствора гидроокиси натрия, разделенный на время, рассчитанный по графику.
см*/мин;
с — концентрация раствора гидроокиси натрия, ммоль/дм^с * 100);
т — масса испытуемой пробы порошка липазы; используемая липаза должна иметь активность от 8 до 20 еди
ниц липазы на миллиграмм.
7