ГОСТ 32372-2013
глутамина, пенициллин (100 ME), стрептомицин (100 мг/мл), и влажную инкубацию при 37 °С,
от 5,0 % до7,5 % С02 в зависимости от буферного раствора.
Питательная среда должна обеспечивать нормальную продолжительность клеточного цикла
или используемой клеточной линии.
4.3 Культура
Клетки из замороженных чистых культур высевают на питательную среду с определенной
плотностью и пересевают, как минимум один раз перед использованием.
Культуры не должны сливаться до конца исследования (на момент определения клеточной
жизнеспособности, определяемой через 48 часов после посева).
Пример-для Balb/c ЗТЗ клеток, растущих в планшете с 96-ячейками, рекомендуемая
плотность посева составляет 1*104клеток на ячейку.
Для каждого исследуемого вещества клетки высевают в два отдельных планшета с 96-ячейкам,
которые затем используют параллельно в течение всего эксперимента при одинаковых условиях
культивирования, исключая период времени, когда один из планшетов облучают (+!гг), а другой
держат в темноте (-Irr).
4.4 Исследуемое вещество
Тестируемый раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.
Рекомендуется, использовать химические вещества и проводить первоначальную обработку
клеток при световых условиях, которые позволят избежать фотоактивации или деградации
исследуемого вещества до облучения.
Исследуемые вещества должны быть растворены в соленом буферном растворе, например, в
сбалансированном солевом растворе Эрла (EBSS) или в других физиологически сбалансированных
солевых растворах, которые не должны содержать протеиновых компонентов, компонентов,
поглощающих свет (например, красителей-индикаторов pH и витаминов) во избежание помех во
время облучения.
Во время облучения необходимо избегать защелачивания, так как клетки выдерживают в
течение примерно 50 минут вне С02 инкубатора. При использовании слабых буферов, таких как
EBSS. это может достигаться путем инкубации клеток при 7,5 % С02. Если клетки инкубируют в 5 %
С02. то должен быть использован более сильный буфер.
Для тестирования веществ, имеющих плохую растворимость в воде, необходимо их растворить
в соответствующем растворителе. Если используют растворитель, то он должен присутствовать в
постоянном объеме во всех культурах, в том числе в отрицательном контрольном эксперименте (с
растворителем), также как и во всех концентрациях исследуемого вещества, и не должен быть
цитотоксичным в данной концентрации. Исследуемые концентрации веществ должны быть
подобраны так. чтобы избежать образования осадка или помутнения раствора.
Рекомендуется использовать в качестве растворителей диметилсульфоксид (DMSO), этанол
(ЕЮН) и другие растворители с низкой цитотоксичностью. Перед использованием необходимо
провести оценку специфических свойств растворителей.
Пример-реакции с исследуемым веществом, гашение цитотоксичекого эффекта,
радикальное вымывание и/или химическая устойчивость в растворителе.
Для увеличения растворимости можно использовать вихревое перемешивание и/или обработку
ультразвуком и/или нагревание до необходимых температур, при условии, что это не повлияет на
стабильность химического вещества.
5 Процедура испытания
5.1 Условия облучения
5.1.1 Источник света
Для фототоксических реакций in vivo используют свет УФ А или свет видимого спектра.
Свет УФ В не используют из-за высокой цитотоксичности, увеличивающейся в 1000 раз. при
изменении длины волны от 313 до 280 нм.
Источник света должен излучать длины волн, поглощаемые исследуемым веществом
(абсорбционный спектр).
Доза света (достижимая в необходимое время экспозиции) должна быть достаточной для
определения известных фототоцитотоксичных веществ. Длины волн и задействованные дозы не
должны быть чрезмерно разрушительными для тест системы.
Оптимальным искусственным источником света является модель солнечного света. Мощность
распределения излучения должна быть близка дневному свету в соответствии с [2].
3