ГОСТ 32372-2013
-
u
Следует избегать выпадения в осадок химического вещества при любой концентрации.
Максимальная концентрация исследуемого вещества не должна превышать 1000 мкг/мл;
осмотическая концентрация не должна превышать 10 ммоль. Используют геометрическую серию
разведений из восьми концентраций исследуемого вещества с постоянным фактором разбавления.
Если существуют данные (из эксперимента по определению диапазона), что исследуемое
вещество не является цитотоксичным вплоть до пороговой концентрации в темноте (-In’), но высоко
цитотоксично при облучении (♦Irr). диапазоны концентраций, выбранные для (+lrr) исследования,
могут отличаться от выбранных в (-Irr) исследовании для выполнения требования об адекватном
качестве данных.
5.2.2 Контрольные эксперименты
5.2.2.1 Чувствительность клеток к облучению, установленная на основе литературных
данных
Клетки необходимо регулярно проверять (во время каждого пятого пересева) на их
чувствительность к источнику света путем оценки их жизнеспособности после экспозиции
возрастающих доз облучения. Должны быть использованы дозы облучения, включая уровни,
значительно превышающие те, которые применялись в ходе эксперимента. Данные дозы легко
определяются измерениями УФ части источника света.
Клетки высевают с плотностью, как в in vitro ЗТЗ NRU тесте на фототоксичность и облучают на
следующий день. Клеточная жизнеспособность затем определяется спустя один день с
использованием теста по поглощению нейтрального красного. Должно быть показано, что
наибольшей результирующей нецитотоксичной дозы (например, в подтверждающей стадии: 5 Дж/см2
УФ А) достаточно для корректной классификации стандартного вещества.
5.2.2.2 Чувствительность к облучению, проверка текущего теста
Необходимо провести качественную оценку, если отношение необлученных клеток к
растворителю в контроле показывает жизнеспособность более 80 % по сравнению с необлученной
культурой.
5.2.2.3 Жизнеспособность контроля с растворителем
Абсолютная оптическая плотность (OD
sicnr
) нейтрального красного, экстрагированного из
контрольного раствора, показывает, выросли ли 1*10* клетки на ячейку, с нормальным временем
удвоения во время двухдневного эксперимента. Тест необходимо оценить по критериям входного
контроля, если средняянеоблученного контроля составляет г 0.4.
5.2.2.4 Положительный контроль
Вещество с известными фототоксическими свойствами должно быть исследовано параллельно
в каждом in vitro ЗТЗ NRU тесте на фототоксичность. Рекомендуется использовать хлорпромазин
(CPZ).
CPZ исследовали в стандартном протоколе в in vitro ЗТЗ NRU тесте на фототоксичность. Был
определен следующий критерий входного контроля: облученный CPZ (+lrr): /С^ = от 0.1 до 2.0 мкг/мл,
необлученный CPZ (-Irr): /С50 = от 7.0 до 90.0 мкг/мл. Фактор облучения (PIF) должен быть больше
шести.
Другие фототоксичныо вещества, относящиеся к тому же химическому классу или показателям
растворимости, что и вещество, подлежащее оценке, могут использоваться для параллельного
положительного контроля вместо хлорпромазина.
5.3 Выполнение эксперимента
5.3.1 Первый день
Поместить по 100 мкл питательной среды в периферийные ячейки 96-луночного планшета
микротитратора. В оставшиеся лунки поместить ло 100 мкл клеточной суспензии по 1*105клеток/мл в
питательной среде (равно 1*104 клеток/луика). Для каждой серии концентраций исследуемого
вещества следует подготовить по два планшета, а также для контрольного теста с растворителем и
положительного контроля.
Инкубацию культуры продолжают в течение 24 часов до тех пор. пока они не образуют
полунепрерывныймонослой.Данныйинкубационныйпериодпозволяетиспользовать
восстановление клеток, адгезию и экспоненциальный рост.
5.3.2 Второй день
После инкубации следует отделить клетки от питательной среды и тщательно промыть 150 мкл
буферного раствора, используемого для инкубации. Добавьте 100 мкл буфера, содержащего
необходимую концентрацию исследуемого вещества или растворителя. Используйте восемь
различных концентраций исследуемого вещества. Инкубируйте клетки с исследуемым веществом в
темноте в течение 60 минут.
6