ГОСТ 32372-2013
Из двух планшетов, приготовленных для каждой серии концентраций исследуемого вещества и
контрольного теста, выбирается случайным образом один, для определения цитотоксичности (-Irr)
(например,контрольныйпланшет),иодин(планшетисследования)дляопределения
фотоцитотоксичности (+lrr).
Для проведения ♦Irr экспозиции, клетки облучают при комнатной температуре в течение 50
минут через крышку 96-луночного планшета наибольшей дозой облучения, которая не является
цитотоксичной. Следует выдержать необлученные планшеты (-Irr) при комнатной температуре в
темноте в течение 50 мин (время экспозиции света).
Необходимо отделить тестовый раствор и дважды тщательно промыть 150 мкл буферного
раствора, используемого при инкубации, но не содержащего исследуемое вещество. Следует
отделить буфер с питательной средой и инкубировать в течение от 18 до 22 часов.
5.3.3 Третий день
5.3.3.1 Микроскопическая оценка
В клетках необходимо исследовать развитие, морфологию и целостность монослоя с
использованием фазово-контрастной микроскопии. Изменения в клеточной морфологии и явления
клеточного роста должны быть зафиксированы.
5.3.3.2 Тест на захват нейтрального красного
Следует промыть клетки 150 мкл теплого буферного раствора, аккуратно слить промывочный
раствор, добавить 100 мкл в концентрации 50 мкг/мл нейтрального красного (NR) (З-амино-7-
диметиламино-2-метилфеназин гидрохлорид, номер ЕС 209-035-8, номер CAS 553-24-2. CI 50040) в
среду без сыворотки и выдерживать в течение трех часов. После инкубации необходимо удалить
среду NR и промыть клетки 150 мкл буферного раствора, затем отфильтровать и удалить
избыточный буферный раствор промоканием или центрифугированием.
Следует добавить точно 150 мкл десорбирующего NR свежеприготовленного раствора (49
частей воды ♦ 50 частей этанола + одну часть уксусной кислоты).
Необходимо аккуратно встряхивать планшет в качалке в течение 10 минут до тех пор. пока NR
не экстрагируется из клеток и не образует гомогенный раствор.
Затем проводят измерение оптической плотности экстракта NR при 540 нм в спектрофотометре,
используя пустые ячейки, как контроль.
6 Данные
6.1 Качество и количество данных
Экспериментальные данные должны позволять проводить значимый анализ доза-ответ,
полученный в присутствии и отсутствии облучения, и. если возможно, концентрации исследуемого
вещества, при которой клеточная жизнеспособность, снижается до 50 % (/С50). Если обнаружена
цитотоксичность, то и диапазон концентраций, и шаг индивидуальных концентраций должны
устанавливаться таким образом, чтобы кривая соответствовала экспериментальным данным.
Как для явно положительных, так и для явно отрицательных результатов основной эксперимент,
поддерживаемый одним или несколькими экспериментами по подбору диапазона доз, может быть
достаточным.
Сомнительные, пограничные или нечеткие результаты должны быть разъяснены в дальнейшем
исследовании. В подобных случаях, должно быть рассмотрено изменение экспериментальных
условий. Экспериментальные условия, которые могут быть изменены, включают диапазон
концентраций, прединкубационное время, время экспозиции облучения. Меньшее время экспозиции
может быть необходимо для нестабильных в воде веществ.
6.2 Оценка результатов
Для возможности оценки результатов могут быть вычислены фотосенсибилизирующий фактор
облучения (PIF) или средний эффект облучения (МРЕ).
Для расчета меры фототоксичности набор дискретных величин зависимости доза-ответ должен
быть аппроксимирован соответствующей непрерывной кривой доза-ответ. Подбор кривой для
данных часто выполняется нелинейным регрессионным анализом. Для оценки влияния разнообразия
данных на подобранную кривую рекомендуется проводить процедуру ступенчатого перехода.
Фотосенсибилизирующий фактор облучения (PIF) рассчитывается по формуле (2).
0
ICS (+Irr)
(
2
)
7