ГОСТ 32372-2013
2.10 МРЕ (средний фотоэффект): Значение измерения, полученное математическим анализом
кривых реакций концентраций,полученных при отсутствии (-Irr) и в присутствии (+lrr)
нецитотоксического облучения УФ A/видимым светом.
2.11 PIF (фактор облучения) (Photo-Irritation-Factor): Фактор, образованный путем сравнения
двух одинаково эффективных цитотоксических концентраций (/См) исследуемого вещества,
полученный при отсутствии (-Irr) и в присутствии (+lrr) нецитотоксического облучения УФ АУвидимого
света.
П р и м е ч а н и е - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие
ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального
агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному
указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по
выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальный стандарты» за текущий год. Если
ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться
заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в
котором дана ссылка на него, применяют в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Принцип метода испытания
In vitro ЗТЗ NRU тест по изучению фототоксичности основан на сравнении цитотоксичности
химического вещества при его воздействии в условиях присутствия и отсутствия нецитотоксичной
дозы имитируемого солнечного света. Цитотоксичность в данном тесте выражается, как зависимое от
концентрации снижение поглощения витального красителя нейтрального красного и измеряемое
через 24 часа после воздействия исследуемым химическим веществом и облучением. Изменение
чувствительности поверхности лизосомной мембраны ведет к лизосомной хрупкости и другим
изменениям, которые постепенно становятся необратимыми. Подобные изменения вызваны
воздействием ксенобиотиков, в результате которого снижается поглощение и связывание
нейтрального красного. Таким образом, становиться возможным отличить жизнеспособные,
поврежденные или мертвые клетки, что является основой данного метода исследования.
Balb/c ЗТЗ клетки выдерживают в питательной среде в течение 24 часов для формирования
монослоев.
Двапланшетас96-ячейкамидлякаждогоисследуемоговеществавыдерживают
предварительно с восемью различными концентрациями вещества в течение часа.
Один из планшетов подвергают воздействию наивысшвй нецитотоксичной дозой облучения,
другой планшет оставляют в темноте. В обоих планшетах в тестируемую среду вносят культуру
клеток и после следующих 24 часов инкубации по поглощению нейтрального красного определяют
жизнеспособность клеток.
Жизнеспособность клеток выражается в процентах как по отношению к необработанному
тестируемым веществом контролю и вычисляется для каждой тестовой концентрации.
Для определения фототоксического воздействия, полученные реакции на концентрации
исследуемых веществ в присутствии и отсутствии облучения, сравниваются с Ю5о уровнем,
полученным в эксперименте с необработанным контролем.
4 Подготовка
4.1 Клетки
Для проведения исследования рекомендуют группу клеток мышиного фибробласта. Balb/c ЗТЗ,
клон 31 или другие клетки и клеточные линии, если условия культивирования клеток адаптированы
для их специфических потребностей.
Клетки регулярно проверяют на отсутствие загрязнения микоплазмой и используют, только,
если загрязнение не выявлено.
Регулярно проверяют УФ чувствительность клеток.
Используют Balb/c ЗТЗ клетки самого низкого пересева, предпочтительно менее 100. так как УФ
А чувствительность клеток возрастает с числом пересевов.
4.2 Среда и питательные условия
При обычном пересеве и во время процедуры эксперимента используют соответствующие
условия питательной среды и условия инкубации.
Пример-для Balb/c ЗТЗ клеток используют среду DMEM (питательная среда для клеток
млекопитающих), с добавлением 10 % сыворотки крови новорожденных телят, 4 ммоль
2