ГОСТ Р 53974—2010
- для кислыхпротеаз — pH 3.0:
- для слабокислых протеаз — pH 5,3;
- для нейтральныхпротеаз — pH 7,0;
- для щелочныхпротеаз — pH 9.0.
4.1 Характеристика методов
4.1.1 Методы определения протеолитической активности основаны на гидролизе гемоглоби
на — животного белка в кислой (pH 3.0), слабокислой (pH 5,3). нейтральной (pH 7,0)и щелочной (pH 9.0)
зонахисследуемым ферментным препаратом, находящимся в растворе, до низкомолекулярных пепти
дов и свободныхаминокислотспоследующей инактивациейфермента путемосаждения непрогидроли-
зованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ) иопределением образовавших пептидови свободных
аминокислот.
4.1.2 За единицуобщей протеолитическойактивности(ПС) принимаюттакоеколичествофермен
та, которое за 1мин при 30 °С приводит гемоглобин в неосаждаемое состояние ТХУ в количестве, соот
ветствующем 1мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0.181 мг). активность выражается в ед.ПС/г
или ед.ПС/см3испытуемого препарата.
4.1.3 Количество белка, превращенного в низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, опреде
ляютпооптическойплотности наспектрофотометре при длине волны л =275 нм или пореакциисвобод
ных аминокислот с реактивом Фолина и дальнейшим определением оптической плотности
образующихся голубыхрастворов на фотоэлектроколориметре придлине световой волны>. =670 нм.
Определение протеолитической активности кислых протеаз осуществляют при pH реакционной
смеси3,0±0.2,слабокислыхпротеаз — при pH5.3i 0,2, нейтральныхпротеаз — при pH 7,0 ♦0,2, щелоч
ныхпротеаз — при pH 9.010,2 ирассчитывают по градуировочному графику, построенномудля тирози на
[2].
4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы, материалы
4.2.1Для определения протеолитической активности используют следующие средства измере
ний. вспомогательное оборудование, посуду, реактивы, материалы:
- весы лабораторные высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г с
пределом допускаемой погрешности в эксплуатации±0,15 мг;
- фотоэлектроколориметр (КФК-3) или спектрофотометр (СФ) любого типа, которые обеспечива
ют измерение оптической плотности анализируемых растворов при длине световой волны л = 670 и
275 нм. соответственно с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1%:
- pH-метрлюбого типадля измерения вдиапазоне от 0 до 14pH с пределом допускаемой погреш
ности в эксплуатации ±0,1 единицы pH;
- холодильник бытовой;
- магнитную мешалкулюбой марки, которая обеспечиваетскорость вращения до 800 мин*1;
- ультратермостатили водяной термостатсточностью регулирования температуры ♦1°С;
- лабораторную центрифугу любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее
7000 мин-1;
- водяную баню любого типа, котораяобеспечиваетподдержание температуры (100 ± 1)X ;
- секундомерс емкостью шкалы счетчика 1мин, ценойделения 1с и погрешностью 11,5 с;
- пипеткиавтоматическиевместимостьюот 0,1до 1.0см3,1,0 см3и от 0.2до5,0см3снаконечниками;
- встряхивательV-3 типа Вортексили аналогичныйдля перемешивания жидкости;
- термометры ртутные стеклянныелабораторные от0 °С до 50 °С иот 04Сдо 100 °С с ценой деле
ния 0.1 °С или 0.5 °С по ГОСТ28498:
- ареометры общего назначения по ГОСТ 18481;
- холодильникобратный по ГОСТ 25336;
- стаканы и колбы стеклянные лабораторные В-1-150 ТС. В-1-800 ТС, Кн-1-100-14/23 ТС по
ГОСТ25336:
- стаканчикидля взвешивания (бюксы) СВ-19/9 по ГОСТ 25336;
- воронки В-75-140 ХС по ГОСТ 25336;
- пробирки П1-14-120ХС или П1-16-150ХС по ГОСТ25336;
- колбы мерные 1-25-2.1-50-2,1-100-2,1-200-2,1-250-2,2-1000-2 по ГОСТ 1770;
- цилиндры 1-25-2.1-50-2.1-100-2,1-250-2по ГОСТ 1770;
- пипетки стеклянные 1-2-2-1.1-2-2-2,1-2-2-5.1-2-2-10 по ГОСТ 29227;
- фарфоровую ступку по ГОСТ 9147;
- бумагуфильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;
- гемоглобин бычийлиофилиэированный. содержание основного вещества не менее 95 %;
з