ГОСТ Р 53974—2010
Анализируемые образцы ферментных препаратов в форме порошка или ультраконцентрата мож
но использовать без предварительной подготовки.
4.4.2 Приготовлениеосновного раствораанализируемогообразцаферментногопрепарата
В стаканчикдля взвешивания помещают сухой анализируемый образец ферментного препарата
массой (0.1000
1
0.0002) г или жидкий ферментный препарат массой (1.00 1 0,02) г и суспендируют в
небольшом количестве дистиллированной воды. Суспензию количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 100 см3,доводятобъем до метки дистиллированной водой при температуре 20 °С итща
тельно перемешивают. Приготовленный раствор ферментного препарата является основным
раствором анализируемого образца.
4.4.3 Приготовление рабочего раствора анализируемого образца ферментного препарата
Рабочий раствор анализируемогообразца ферментногопрепарата готовятизосновного раствора
по4.4.2 путем разведения его вдистиллированной воде.
Количествофермента, взятогона анализ, должно бытьрассчитанотак,чтобы вреакционнойсмеси
по4.5.2 присутствовал избытоксубстратаи чтобы измеряемые величины оптической плотности по4.5.3
при колориметрировании в кюветес толщиной поглощающегосветслоя 10 мм лежали в диапазоне зна
чений 0.1—0,21.
При отклонении оптической плотности от указанных значений необходимо подобрать разведение
препарата таким образом, чтобы оптическая плотностьокрашенных растворов реакционной смеси Dпо
4.5.3 соответствовала указанным пределам диапазона.
Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях. Для испытания
берутдве параллельные навески препарата.
Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.
4.5 Проведение испытания
4.5.1 В две опытные пробирки (16 х 150 мм) вносят по 1 см3субстрата по 4.3.2, помещают их в
ультратермостат при температуре (30.0± 1.0) °С ивыдерживают втечение 5 мин.
4.5.2 В пробирки с субстратом добавляют по 1 см3 рабочего раствора анализируемого образца
ферментного препарата по4.4.3, предварительно термостатированного при температуре (30,0± 1,0) °С 3
— 4 мин; пробирки встряхивают и оставляют на гидролиз ровно на 10 мин при температуре (30.0 i
1.0) °С (с точностью, определяемой по секундомеруот начала ферментативной реакции).
4.5.3 По окончании реакциидобавляют вобе пробирки по 2 см3раствора ТХУ по4.3.4, чтобы пре
рвать ферментативную реакцию иосадить непрогидролизовавшийся белок, а также высокомолекуляр
ные продукты гидролиза.
4.5.4 Смесь перемешивают идля обеспечения полного осаждения белка выдерживают пробирки
со смесью в течение 10 мин. Затем смесь фильтруют в сухие пробирки. Фильтрат должен быть совер
шенно прозрачен. Вчистые пробирки вносят по 1см3фильтрата, добавляют по 5 см3 раствора углекис
логонатрия по4.3.3. перемешиваюти приливаютпо 1 см3рабочего растворареактива Фол ина no4.3.5.2.
Реакционную смесь выдерживают ровно20 мин (посекундомеру). В процессе реакции растворы приоб
ретают голубую окраску, интенсивность которой определяют на фотоэлектроколориметре при длине
световой волных =670нм вкюветахтолщинойпоглощающего свет слоя 10 мм всравнениисконтролем.
4.5.5 Контрольный образец готовят, прибавляя реактивы вобратной последовательности. Дляэтого
в контрольную пробирку вносят 1см3 рабочего ферментного раствора того же разведения по 4.4.3. как ив
опыте. добавляют2см3ТХУ по4.3.4. вносят 1 см3субстратапо4.3.2 и выдерживаютв ультратермостатепри
температуре 30 °С втечение 10мин.Дальнейшие операцииосуществляют аналогично 4.5.2.
4.6 Обработка результатов
4.6.1Протеолитическую активность, ед.ПС/гили ед.ПС/см3 испытуемого препарата, рассчитыва
ютпо формуле
4
ПС =
ГЭ
D
10
т
■d,
(
1
)
где D — оптическая плотность исследуемого раствора;
4 — отношение объемов реакционной смеси ираствора фермента последобавления ТХУ;
ТЭ — тирозиновыйэквивалент, определяемый по4.3.6:
10 — время гидролиза субстрата, мин,
т — масса ферментного препарата, взятая на гидролиз (расчет ведется на 1см3рабочего раствора
анализируемого образца ферментного препарата), г;
d — плотностьферментного препарата (дляжидких препаратов), г/см3.
7