С. 6 ГОСТ 28573-90
5.2. Подготовка к анализу
Из краниальной полой, ушной или хвостовой вены свиней берут 10—15см3крови в пробирки,
содержащие гепарин в количестве 10—20 ЕД/см3.
5.3. Проведение анализа
Пробирки с отобранными пробами кропи помещают в вертикальном положении в термостат
при температуре 37 "С. Пипеткой отбирают верхний слой плазмы, содержащей лейкоциты с эрит
роцитами. Отобранную плазму крови вносят по 50—100 мм1в 2—4 лунки панели, по 1—3 см3в 2—
4 пробирки и готовят двукратные разведения суспензии клеток с 1:2 до 1:128. Для разведения
исполь зуют стерильный физиологический раствор, содержащий пенициллин 100—200 ЕД/см3.
стрептоми цин 100—200 мг/см3 и гепарин 10—15 ЕД/см3.
Панели с приготоалемными разведениями лейкоцитарной фракции крови просматривают под
инвертированным, пробирки —под обычным микроскопом.
5.4. Оценка результатов
При положительной реакции обнаруживают гемадсорбцию, проявляющуюся в виде -розетки»
эритроцитов на поверхности отдельных клеток. При отсутствии «розеток* плазму с клетками рас
сматривают как культуру лейкоцитов. Для этого панели с культурой клеток продолжают инкубиро
вать при температуре 37 *С и результаты оценивают по п. 3.4.
При отсутствии реакции гемадсорбиии препараты высушивают, обрабатывают ацетоном и
ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции.
6. МЕТОД НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Сущность метода заключается в соединении иммуноглобулинов АЧС исследуемой сыворотки
свиней с вирусоспецифическим антигеном тест-препаратов АЧС и обнаружении комплекса «анти
ген-антитело» обработкой антисвиными ФИТЦ-нммуноглобулннами и люминесцентной микроско
пией.
6.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Микроскоп люминесцентный.
Термостат.
Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 мин-1.
Холодильник бытовой.
Стекла предметные по ГОСТ 9284.
Стекла покровные по ГОСТ 6672.
Раствор фосфатный буферный pH 7,2—7.4; готовят по п. 2.2.1.
Раствор глицерина буферный; готовят по п. 2.2.2.
Парафин по ГОСТ 23683.
Тест-препараты специфические АЧС и отрицательные; готовят следующим образом: специфи
ческие АЧС тест-препараты готовят заражением перевиваемой культуры клеток почки поросенка
(РК-15), выращенной на покровных стеклах в пробирках, вирусом АЧС, высушиванием и обработ
кой ацетоном. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично, но не заражая вирусом АЧС.
Хранят в герметической емкости при температуре минус 20 ‘С.
ФИТЦ-им.муноглобулины антисвипые, представляющие собой иммуноглобулины кролика или
осла, иммунизированных иммуноглобулинами сыворотки свиньи, и меченные ФИТЦ.
Сыворотки свиньи отрицательные и положительные к вирусу АЧС.
6.2. Подготовка к анализу
6.2.1. Пробы крови —по п. 5.2.
6.2.2. Суспензии органов —по п. 3.2.3.
6.3. Проведение анализа
Капли положительных и отрицательных к вирусу АЧС сывороток и суспензий органов, разве
денные в фосфатном буферном растворе 1:20, наносят на предметные стекла и добавляют специфи
ческие АЧС и отрицательные тест-препараты. Предметные стекла помещают в термостат и
выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Затем тест-препараты промывают в фосфатном буфер ном
растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора, ополаскивают дистиллированной водой и
подсушивают при комнатной температуре. Далее тест-препараты обрабатывают антисвиными
ФИТЦ-иммуноглобуликами, как указано в п. 2.3. и просматривают под люминесцентным микро
скопом.