С. 2 ГОСТ 28573-90
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
Ацетон по ГОСТ 2603.
Эфир этиловый по ГОСТ 22300.
Парафин по ГОСТ 23683.
Глицерин для микроскопии по ГОСТ 6824.
Гепарин.
Раствор фосфатный буферный pH 7.2—7.4.
ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.
ФИТЦ-иммупоглобулнны классической чумы свиней (КЧС).
Вила дистиллированная.
2.2. Подготовка к анализу
2.2.1. Приготовление фосфатного буферного раствора pH 7,2—7,4
Раствор А. В I дм3дистиллированной воды растворяют 1,78 г двузамещенного фосфорнокис
лого натрия.
Раствор Б. В 1дм3дистиллированной воды растворяют 1.36 г однозамешейного фосфорно
кислого калия.
К 850 см3раствора А добавляют 250см3раствора Б. В 1дм3 полученной смеси растворяют 8,5 г
хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют в автоклаве в течение 2,5 ч при 2 атм.
2.2.2. Приготовление буферного раствора глицерина
9 см3глицерина смешивают с 1см3фосфатного буферного раствора.
2.2.3. Приготовление тест-пренаратов (срезов, мазков-отпечатков)
2.2.3.1. От лимфатических узлов (подчелюстного, портального и мезентериального), селезенки
и легких двух-трех свиней при помощи криостата берут пробы массой 5—10 г. Из проб готовят срезы
толщиной 5 мк и помещают их на покровные стекла, предварительно обезжиренные смесью спирт-
эфира в соотношении 1:1. Из каждого органа готовят четыре тест-препарата.
2.2.3.2. Из лейкоцитов крови больных и интактных свиней готовят мазки-отпечатки. Для
этого из краниальной полой вены берут 10—15 см3 крови в пробирку, содержащую гепарин 10—
20 ЕД/см3. Кровь в пробирке осторожно перемешивают и выдерживают 30 мин при темпе ратуре 37
*С. Пастеровской пипеткой отбирают плазму с лейкоцитами, переносят в центрифуж ную
пробирку и центрифугируют 10 мин с частотой вращения 1000 мин-1. Надосадочпую
жидкость удаляют, а лейкоциты осадка наносят на покровные стекла и готовят по четыре
мазка-отпечатка на одну пробу крови.
2.2.3.3. Тест-препараты высушивают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, поме
щают в сосуд с ацетоном, выдерживают 10—15 мин при температуре минус 10 *С и подсушивают на
воздухе при комнатной температуре до полного испарения ацетона.
2.3.Проведение анализа
Подготовленные тест-препараты обрабатывают ФИТЦ-иммуноглобулинами АЧС и КЧС.
Для этого на предметные стекла, помещенные во влажную камеру, наносят капли ФИТЦ-имму-
ноглобулинов и на них помешают тест-препараты срезом или мазком-отпечатком вниз. Камеру
помещают в термостат и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Затем тест-препараты
промывают в фосфатном буферном растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора,
ополаскивают в дистиллированной воде, подсушивают при комнатной температуре и помешают
на капли раствора глицерина, нанесенные на предметные стекла. Края предметных стекол
окантовывают расплавленным парафином. Тест-препараты просматривают иодлюминесцентным
микроскопом.
2.4. Оценка результатов
В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, зараженных вирусом АЧС и обработанных
ФИТЦ-иммуноглобулином АЧС, специфический антиген обнаруживают по свечению зеленого или
желто-зеленого цвета в форме отдельных гранул (включений) в перинуклеарной зоне на фоне
диффузного свечения зеленого или желто-зеленого цвета цитоплазмы клеток лимфоидного ряда или
макрофагов.
В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, не зараженных вирусом АЧС, обнаружи
вают тусклое свечение клеток серо-зеленого цвета.
При обработке ФИТЦ-иммуноглобулином КЧС тест-препаратов, приготовленных из проб
органов и крови свиней, больных КЧС, обнаруживают ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток,
часто расположенных группами.