С. 4 ГОСТ 28573-90
3.2.2. Приготовление культуры клеток костного мозга
Поросят обескровливают через сонную артерию или сердце с помощью полого ножа. Кровь
собирают в стерильный сосуд и выдерживают при температуре 37 "С в течение 1—3 ч. Затем
сыворотку отсасывают в стерильный флакон и осветляют центрифугированием при 2000—2500в
течение 30 мин. Сыворотку инактивируют при 56 ‘С в течение 30 мин.
После обескровливания у поросят удаляют кожный покров вместе с мышечной тканью в
области бедренной кости, предварительно продезинфицировав этот участок йодированным спиртом, и
отделенную бедренную кость разрезают на расстоянии 2 см от суставов. Изатекают костный мозг,
помещают в колбу с магнитом, содержащую 0,1 % гидролизата лактальбумина на растворе Эрла.
Содержимое колбы перемешивают на магнитной мешалке в течение 15 мин и центрифугируют при
2000—2500 мин-1в течение 10 мин. Осадок ресуспензируют ростовой средой и определяют количе
ство клеток, как указано в п. 3.2.1. Суспензию клеток разбаатяют ростовой средой до концентрации
4—6 млн/см’ и разливают в чашки Карреля и в пробирки с пластинками из покровных стекол. К
питательной среде, приготовленной по п. 3.2.1, добавляют сыворотку свиньи до концентрации 10 %.
3.2.3. Приготовление суспензии органов
Пробы селезенки, легкого, лимфатическихузлов (подчелюстного, мезентериального) встериль
ных условиях очищают от соединительной и жировой тканей, делают навески массой 2—3 г,
тщательно растирают каждую вотдельности в ступке со стерильным стеклянным песком
идобаатяют стерильный фосфатный буферный раствор до соотношения 1:10. Приготовленные
суспензии под вергают 1—2-кратному замораживанию и оттаиванию и центрифугируют при 3000
мин-1в течение 15—20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, добаатяют пенициллин 500
ЕД/см3,стрептомицин 500 мг/см3, выдерживают 1ч при температуре 37 “С и используют для
инокуляции культуры клеток лейкоцитов или костного мозга.
Оставшийся после приготовления суспензий материал обезвреживают в растворе монохлора
мина Б с массовой долей 5 % с последующей утилизацией после термической обработки.
3.3. Проведение анализа
Культуру лейкоцитов или костного мозга, выращенных в чашках Карреля и в пробирках,
ииокулируют приготовленными суспензиями органов без удаления питательной среды. На каждую
пробу берут по четыре чашки Карреля и 8—10 пробирок. В первые две чашки вносят по 1,0 см3, в две
другие чашки и в пробирки —по 0.1 см3 суспензии и инкубируют при температуре 37 ’С в
течение 5—7 сут.
Культуру клеток просматривают на наличие реакции гемадсорбции при малом увеличении
микроскопа (К) х 10). Первый просмотр проводят через 15—18 ч после инокуляции. Перед просмот
ром чашки слегка встряхивают.
При отсутствии реакции гемадсорбции в течение 5—7 сут проводятдва пассажа на аналогичной
культуре клеток. Параллельно культуру клеток, инокулированную в пробирках, обрабатывают мето
дом прямой иммунофлуоресценции. Для этого пластинки извлекают из пробирок, высушивают,
помешают вацетон на 10 мин и обрабатывают ФИ’ГЦ-иммуноглобулином АЧС, как указано в п. 2.3.
3.4. Оценка результатов
При наличии в исследуемом материале вируса АЧС наблюдают реакцию гемадсорбции, про
являющуюся в виде «розетки* эритроцитов на поверхности отдельных клеток. При легком встряхи
вании эритроциты остаются на клетках.
Результат выделения вируса АЧС считается положительным при наличии реакции гемадсорб
ции в инокулированной культуре клеток и при положительной реакции методом прямой иммуно-
флуоресценции.
Результат выделения вируса АЧС считается отрицательным при отсутствии реакции гемадсорб
ции в инокулированной культуре клеток втечение трех пассажей и отрицательной реакции методом
прямой иммунофлуоресценцни.
4. МЕТОД ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ
Сущность метода заключается в воспроизведении заболевания африканской чумой при введе
нии восприимчивым и иммунным к вирусу классической чумы свиньям суспензии органов и крови,
взятых от вынужденно убитых больных и павших свиней.
4.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 “С.