ГОСТ 28573-90 С. 3
3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
Сущность метода заключается в инокуляции культуры лейкоцитов или костного мозга свиньи
исследуемого материала и обнаружении реакции гемадсорбиии или вирусоспеиифического антигена
в клетках прямой иммунофлуоресценцией.
ЗЛ. Аппаратура, материалы и реактивы
Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 ‘С.
Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту’ вращения 5000 мин-1.
Шкаф сушильный.
Микроскоп биологический.
Микроскоп люминесцентный.
Холодильник бытовой.
Мешанка магнитная.
Пипетки градуированные вместимостью I. 2, 5 и 10 см3
п о
ГОСТ 29227.
Пробирки бактериологические.
Камера Горяева.
Стекла покровные по ГОСТ 6672.
Стекла предметные по ГОСТ 9284.
Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см3по ГОСТ 1770.
Банка цилиндрическая по ГОСТ 25336.
Ступка фарфоровая с пестиком.
Чашки Карреля.
Трубка силиконовая.
Иглы типа «Рекорд» 1Л1-16-90-115.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
Трепановый синий, раствор с массовой долей 0,5 %.
Монохлорамин Б технический по ГОСТ 14193, раствор с массовой долей 5 %.
Гидролизат лактальбумина на растворе Эрла, раствор с массовой долей 0,1 % (ростовая среда):
готовят в соответствии с указаниями изготовителя.
Пенициллин.
Стрептомицин.
Гепарин.
Раствор фосфатный буферный pH 7.2—7,4; готовят по п. 2.2.1.
Ацетон по ГОСТ 2603.
ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.
Вода дистиллированная.
3.2. Подготовка к анализу
3.2.1. Приготовление культуры лейкоцитов крови
Культуру лейкоцитов готовят из крови моровых поросят крупной белой породы живой массой
25—30 кг. Кровь берут в количестве 10—15 см3из краниальной полой вены в стерильный цилиндр
вместимостью 50—100 см3, содержащий гепарин 10—20 ЕД/см3. выдерживают 40—60 мин при
тем пературе 37 ’С и отделяют верхний слой, состоящий из плазмы и лейкоцитов. Плазму с
лейкоцитами тщательно перемешивают и определяют концентрацию клеток.
Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Для этого к пробе клеточной суспензии добавляют
равный объем раствора трепанового синего с массовой долей 0.5 %. Количество клеток определяют
по всему полю камеры, имеющей 25 больших и 100 малых квадратов. Число клеток умножают на
2200. Полученный результат соответствует количеству клеток в 1см* суспензии.
Для посева используют суспензию, содержащую 4—6 млн лейкоцитов в 1 см3. Для получения
средней посевной концентрации 5 млн/см3к алазме слейкоцитами добавляют необходимое количество
питательной среды pH 7,2—7,4следующего состава: 0,1 % гидролизата лактальбумина на растворе Эрла,
пенициллин 100—200 ЕД/см3, стрептомицин 100—200 мг/см3, гепарин 10—20 ЕД/см3.
Приготовленную суспензию клеток разливают по 9—10 см3в чашки Карреля или по 2—3 см3
в пробирки с пластинками из покровных стекол, помещают в термостат при температуре 37 *С и
выдерживают в течение 2—3 сут.
Для исследования используют культуру клеток с плотностью не менее 400—500 клеток в пале
зрения микроскопа (увеличение 10 х 10) с отчетливой ростовой активностью. Клетки должны быть
прозрачными, без зернистости, различной величины, без признаков дегенерации.