ГОСТ Р 53047—2008
Одновременно готовят контрольную пробу на реактивы, для чего в пробирку вносят 0.5 см3окра
шенногосубстратапо5.3.2. добавляют0.5см3ацетатногобуферного раствора по5.3.1 и перемешивают с
помощью вортекса со скоростью встряхивания 1000— 1500 мин* ’.
Все пробирки (семьопытныхи одну контрольную)помещают в термостат (ультратермостат)стем
пературой (40
1
1) °С на20 мин (посекундомеру).
После извлечения пробирок из термостата во все пробиркидобавляют по2.5 см3 96 %-ного этило
вогоспирта (осадителя).
Все пробирки выдерживают 10 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют при
5000—7000 мин-1.
Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 490 нм
против контрольной пробы на реактивы.
По полученным значениям строят градуировочный график: на оси абсциссоткладываютактивнос
ти разведений стандартного раствора ксиланазы КсА. ед/см3: на оси ординат — соответствующие им
значения оптических плотностей в единицах ОП.
Дляпостроения каждойточкиградуировочногографика вычисляютсреднеарифметическоезначе
ние оптической плотноститрехпараллельныхизмеренийдля каждойактивностистандартногораствора
ксиланазы.
Градуировочный графикстроятдля каждой новой партииазоксилана, атакжепри заменеприбора.
5.4 Подготовка пробы
5.4.1 Отбор проб проводят по4.4.1.
5.4.2 Приготовлениеосновного раствора анализируемого образца проводят по4.4.2.
5.4.3 Приготовление рабочего раствора анализируемого образца
Рабочий раствор готовят из основного раствора по 5.4.2 путем разведенияего дистиллированной
водой таким образом, чтобы при определенииактивностиоптические плотностиопытного иконтрольно
го растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.
Рабочий раствордолжен содержатьот 0.15 до 0.75 единицактивности в 1см3.
5.5 Проведение анализа
5.5.1 В три опытные пробирки вместимостью 10 см3вносят по 0.5 см3раствора окрашенного суб
страта по 5.3.2. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой (40 ♦1) X и
выдерживают в течение 5 мин. затем вносят 0,5 см3 рабочего раствора анализируемого образца, пред
варительно прогретоговультратермостате или на водянойбане стемпературой(40i 1) "С. иперемеши-
ваютсломощью вортекса со скоростью встряхивания 1000 — 1500 мин1.
5.5.2 Одновременно готовят контрольную пробу: в пробирку вместимостью 10 см3вносят 0,5 см3
раствора окрашенного субстрата по 5.3.2,2.5 см396 %-ного этилового спирта (осадителя) и перемеши
вают с помощью вортекса со скоростью встряхивания 1000—1500 мин-1, после чего добавляют 0.5 см3
рабочего раствора анализируемогообразца.
5.5.3 Все пробирки (три опытные иодну контрольную)закрывают пробками и помещают в ультра
термостатс температурой (40 ♦1) °Си выдерживают в течение20 мин (при анализе кормов — 1ч).
5.5.4 В три опытные пробирки вносят по 2.5 см396 %-ногоэтилового спирта (осадителя). переме
шиваютс помощью вортекса со скоростью встряхивания 1000 — 1500 мин*1и выдерживают 10 мин при
комнатной температуре.
5.5.5 Пробирки (три опытные и одну контрольную) центрифугируют 5 мин при 5000—7000 мин*1.
Отбирают супернатант и проводят измерение оптической плотности на фотоколориметре или спектро
фотометре при 490 нм против контрольной пробы.
5.6Обработка результатов
5.6.1 Активность эндоксиланазы (эндо-КсА) в анализируемом образце, ед/г, рассчитывают по
формуле
<5)
КсА = * ,
с
гдеА — активностьразведения рабочегораствора, определенная по градуировочному графику 5.3.4,
ед/см3;
с — массовая концентрация ферментного препарата в 1см3 рабочего раствора анализируемого
образца, г/см3,по формуле2.
5.6.2 Заокончательныйрезультатпринимаютсреднеарифметическоезначениерезультатовдвух
параллельныхопределений, округленноедопервогодесятичного знака (Х± Д),ед/г. при доверительной
вероятности Р= 0.95. где Д = 0.016Х. Границы погрешности 6 = ±7%.
8