ГОСТ Р 52996—2008
4 Сущность метода
Активность щелочнойфосфатазы для образца измеряетсяпутем непрерывногофлуориметричес-
кого прямого кинетического анализа. В субстрате нефлуоресцентного ароматического монофосфорно-
го эфира. 2-[2-бензотиазолил]-6’-гидроксибвнзотиазол фосфат, в присутствии любой щелочной
фосфатазы, образованнойизэтого образца, происходитгидролизегофосфатного радикала, производя
продуктс интенсивной флуоресценцией. Флуориметрическое измерениеактивности щелочной фосфа
тазы проводят при температуре 38 °Св течение трех минут, используя субстрат. Сюда включена
преин кубация субстрата и образца с последующим многократным кинетическим считыванием
скорости реакции.
П р и м е ч а н и е - Хотя испытание длится 3 мин. первая минута является равновесным периодом для
обеспечения температуры образца 38 4С. Измерения активности фактически начинаются со второй минуты и про
должаются до конца третьей минуты (т. е. 2 мин).
5 Реактивы
Используются только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других указаний, и
дистиллированная или деминерализованная вода или вода аналогичной чистоты.
5.1 Субстрат Флуорофоса® в пробирках, каждая из которыхсодержит 144 мгпорошка Флуорофо-
са®.
Этот субстрат нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира. 2-[2-бензотиазо-
лил]-6’-гидроксибензотиазол фосфат (Флуорофос®). Субстрат Флуорофоса® остается стабильным в
течениедвухлет, если его хранить в закрытых пробиркахпри температуре от 2 °С до 8 °С.
5.2 Буферный растворсубстрата, буферный раствордиэтаноламина (DEA), с(DEA) =2.4 моль1дм3,
с pH 10.0 в пробирках вместимостью 240 см3каждая.
Буферный раствор субстрата остается стабильным в течениедвух лет. если его хранить в закры
тых пробирках при температуре от 2 °С до 8 °С.
5.3 Рабочий субстрат
Оставляют субстратФлуорофоса® и буферный раствор субстрата додостижения комнатной тем
пературы. Добавляютсодержимое одной пробирки с буферным раствором субстрата (240 см3)к содер
жимому одной пробирки Флуорофоса® (144 мг) (см. 5.1) и хорошо перемешивают, переворачивая, в
течение 3 мин. Используют желтое стеклодля защиты против света.
Перед использованием полученный раствор выдерживают при комнатной температуре как мини
мум 30 мин.
Используют аналого-цифровой тест, описанный в 9.4.1.1. для проверки устойчивости готового к
использованию субстрата.
Рабочий субстрат остается стабильным в течение 60 дней, если он защищен от света и хранится
при температуре от 2 “Сдо 8 °С. или в течение 8 ч, если хранится при 38 °С. Не следует использовать
рабочий субстрат, если получено показание выше 1200.
П р и м е ч а н и е — Попученный объем рабочего субстрата (240 мп)явпяетсядостаточным прибпизитепь-
нодля 115 тестов.
5.4 Рабочие калибровочные растворы. Флуорожелтый® (FY). 2-{2-беизотиазолил]-6’-гидрокси-
бензотиазол в буферном растворе DEA.
Рабочие калибровочные растворы остаются стабильными в течение 18 мес. когда их хранят при
температуре от 2 °С до 8 вС.
5.4.1 Калибровочный растворА. содержащий 0 мкмоль/дм3Флуорожелтого®.
5.4.2 Калибровочный раствор В. содержащий 17,24 -10~3 мкмоль/дм3Флуорожелтого®.
5.4.3 Калибровочный раствор С. содержащий 34.48 10 3мкмоль/дм3Флуорожелтого®.
5.5 Раствордляежедневного контроля прибора, содержащий 34.48 •10 3мкмоль/дмэФлуорожел
того®.
6 Аппаратура
6.1Фильтрованный флуориметр с термостатически регулируемым держателем кюветы при под
держании температуры (38 ± 1) °С и правоугольной оптической системой, допускающей возбуждение
при длине волны 440 нм ииспускание при 520—560 нм (например, приборФлуорофос®).
2