ГОСТ Р 52833—2007
3.6.2 блокирующий реагент: Соединение, используемое для насыщения остаточных точек
неспецифического связывания на твердой фазедо иво время процедуры гибридизации сДНК-зондом.
3.6.3 гибридизация: Специфическое связывание комплементарных последовательностей нук
леиновых кислот в соответствующихусловиях реакции.
3.6.4 специфичность: Способностьприменяемого метода распознавать исключительно целе
вую последовательностьи отличатьее от сходныхпоследовательностей и загрязняющих примесей.
4 Принцип
4.1 Общие положения
Определение патогенных микроорганизмов состоит из следующих последовательно выполняе
мыхэтапов:
а) предварительное микробиологическое обогащение анализируемой пробы (при необходимос
ти; см. 4.2);
б) выделение и очистка нуклеиновых кислот (при необходимости: см. 4.3);
в) амплификацияцелевойпоследовательностинуклеиновыхкислот вПЦРс использованиемспе
цифичныхпраймеров (см. 4.4);
г) обнаружение специфичных ПЦР-продуктов (см. 4.5).
4.2 Предварительное микробиологическое обогащение
При необходимости можно нарастить количество клеток анализируемого патогенного микроорга
низма путем стимуляции его роста в пробе на селективных или неселективныхжидкихпитательныхсре
дах.
4.3 Выделение нуклеиновых кислот
Клетки патогенных микроорганизмов из анализируемой пробы или обогащенной культуры лизиру
ютсядлявысвобождениясодержащихся внихнуклеиновыхкислот. При необходимостипроводятдопол
нительныйэтап отделения клеток перед лизисом и/илиэтап очистки после него.
4.4 Амплификация ПЦР
Специфичные последовательности нуклеиновых кислот амплифицируются с использованием
метода ПЦР. Эта реакция представляет собой циклический процесс, состоящий изтрехэтапов:
а) денатурациядвухцепочечнойДНК (диДНК);
б) отжигпраймеров на комплементарной целевой последовательности;
в) элонгация гибридизовавшихся праймеров с помощью термостабильнойДНК-полимеразы.
РНК обнаруживают методом ПЦР, если предварительно перевести ее в форму копийной ДНК
(кДНК) методом обратной транскрипции.
П р и м е ч а н и я
1 После денатурации двухцепочечной ДНК два олигонуклеотидных праймера отжигаются (гибридизуются)
на целевой амплифицируемый сегмент последовательностиДНК. Праймеры направлены друг противдруга в соот
ветствии с их ориентацией на целевой последовательности.
2 Двухцепочечные участки формируются в результате специфического спаривания оснований между прай
мерами и целевой последовательностью, ограничивающими амплифицируемый сегмент ДНК и выполняющими
роль позиций начала синтеза ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.
3 Повторяющийся (циклический)процесстепловойденатурации, отжига праймеров и синтезаДНК приводит
к практически экспоненциальной амплификации ограниченного праймерами сегмента ДНК.
4.5 Обнаружение и подтверждение ПЦР-продуктов
ПЦР-продукты обнаруживают методами электрофореза в агарозном геле или ПЦР в реальном
времени.
Дляметода электрофорезавагарозномгелеидентичностьПЦР-продукта подтверждаютлюбым
из следующих методов: гибридизацией, определением нуклеотидной последовательности или рес
трикционным анализом.
5 Анализируемый материал
В качество анализируемого материала могут быть использованы любые пищевые продукты или
кормадля животных, при условииотсутствияэффекта ингибирования ПЦРэкстрактом нуклеиновыхкис
лот. полученным из пробы таких продуктов.
4