С. 6 ГОСТ 20264.2-88
лиз ровно на 10 мин при температуре 30°С. Через 10 мин добав
ляют в обе пробирки по 4 см3 раствора ТХУ, чтобы прервать фер
ментативную реакцию и осалить белок и высокомолекулярные про
дукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь н для обеспечения
полного осаждения выдерживают пробирки со смесью при темпе
ратуре 30°С еще н течение 20 мин. Затем смесь фильтруют в сухие
пробирки. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Отбира
ют в пробирки с предварительно налитыми туда 5 см3 раствора
углекислого натрия концентрацией 0,5 иоль/дм* no 1 см3 фильтра
та, перемешивают н быстро приливают по 1 см* рабочего раство
ра реактива Фолнна. Дают реакционной смеси постоять 20 мин.
После реакции растворы приобретают голубую окраску, интенсив
ность которой определяют фотоэлектрическим колориметром про
тив контроля.
Контрольный опыт готовят, прибавляяреактивы в обратной
последовательности: для этого в контрольную пробирку наливают
2 см3 ферментного раствора того же разведения, как и вопыте, до
бавляют 4 см3 ТХУ, выдерживают в ульгратермостате при темпе
ратуре Э0Х в течение 10 мин, а затем вносят 2 смг субстрата.
Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют, отби
рают в сухую пробирку с предварительно налитыми туда 5 см3
раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм3 1 см3
фильтрата, перемешивают, добавляют 1 см3 рабочего раствора
реактива Фолина.
Колориметрирование проводят фотоэлектрическим колоримет ром
в диапазоне длин волн 630—670 нм в кюветах с толщиной по
глощающего свет слоя 10 мм.
Значения оптической плотности должны лежать в диапазоне
0,07—0,45 для кислых протеиназ и 0,2—0,6 для нейтральных и ще
лочных протеиназ.
При отклонении оптической плотности от указанной необхо
димо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая
плотность укладывалась в данные пределы.
2.3.8. Построение градуировочной характеристики
Для вычисления протеолитической активности строят градуиро
вочную характеристику по тирозину и по ней вычисляют тирознно-
вый эквивалент (ТЭ), то есть ту оптическую плотность, которую
бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см3стандартного раствора. Этот эк
вивалент необходимо установить для каждой новой партии реак
тива Фолнна и каждого фотоэлектрического калориметра.
Для построения градуировочной характеристики готовят раст
вор тирозина концентрацией Ю~3 моль/дм3. Для этого 181,2 мг
чистого тирозина растворяют в растворе соляной кислоты концент
рацией 0,2 моль/дм3 в мерной колбе вместимостью I дм3. Из этого
неходкого раствора тирозина готовят дальнейшие разведения сле
дующим образом.