ГОСТ Р 51484-99
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(обязательное)
Приготовление липазы и проверка активности
Л.1 Приготовление липазы
Охлаждают 5 кг свежей свиной поджелудочной железы до ОX. Удаляют твердый жир и соединительную
ткань, се окружающую, и измельчают железу до получения жидкой пасты. Перемешивают эту пасту с 2.5дм3
безводного ацетона в течение 4—6 ч на холоде и затем центрифугируют.
Экстрагируют остаток еще три раза, используя тот же объем ацетона: дважды используют смесь одной
объемной доли ацетона и одной объемной доли диэгилового эфира и дважды используют диэтиловый эфир.
Высушивают остаток втечение 48 ч под вакуумом до образования порошка. Порошок храню вхолодиль
нике.
А.2 Проверка активности липазы
Готовзтг масляную эмульсию, встряхивая смесь 165 см3 гуммиарабика концентрации 100 г/дм3, 15 г
дробленого льда и 20 см3предварительно нейтрализованного масла в течение 10 мин на пригодном для этой
цели миксере.
Наливают последовательно 10 см3 эмульсии. 0.3 см3 раствора хлората натрия (200 г/дм3) и 20 см3
дистиллированной воды в стакан вместимостью 50 см3.
Помешают стакан в водяную баню при 37 X (см. примечание).
В стакан опускают электроды pH-метра и пропеллерную мешалку и. используя бюретку вместимостью
5 см3, приливают но каплям расгвор г (NaOH) «=0,1 моль/дм3до тех пор. пока нс будег достигнуто значение
pH 8,5.
Приливают соответствующий (см. примечание) и точно отмеренный объем 0,1 96-ной водной суспензии
анализируемого порошка липазы. Как только pH достигнет значения 8,3 по шкале pH-метра, включают
секундомер и добавляют раствор молярной концентрации с (NaOH) = 0,1 моль/дм3 так. чтобы значение
pH 8.3 сохранялось. Записывают объем раствора щелочи, приливаемого кажтую минуту в течение 10мин.
Наносят полученные данные на график, откладывая на оси X время в минутах и на оси Уобьсм в
сантиметрах кубических раствора щелочи, использованного для поддержания постоянного значении pH.
Результат должен выражаться в виде прямой линии.
П р и м е ч а н и я
1 Когда используют жидкое масло, гидролиз проводят при 37 X. Однако для испытания устанавливают
температуру 40 X, позволяющую проанализировать жиры, имеющие температуру плавления до 45 X.
2 Для испытания образцов используют такое количество суспензии липазы, при кагором потребляется
1см3раствора щелочи за 4—5мин. Такой результат обычно достигается при использовании 2—5 см3суспензии
липазы, то есть от 1до 5 мг порошка.
Единица липазы определяется как количество энзима, которое требуется для высвобождения 1 мкмоль
кнелагы в минуту при 37 X и pH 8.3.
Активность А. выраженную в единицах липазы на миллиграмм использованного порошка, определяют
по формуле
где V— обьсм израсходованного раствора гидроокиси натрия.разделенный на время опьгга,рассчитанный по
зрафнку.см’/мин;
т — масса испытуемой пробы порошка липазы; используемая липаза должна иметьактивностьот 8 до 20
единиц липазы на миллиграмм;
с — концентрация раствора гидроокиси натрия.ммоль/дм3—с - 100 ммоль/дм3.
7168