ГОСТ Р 57200—2016
К колбе присоединяют обратный холодильник и нагревают в течение 24 ч. Первые 5-8 ч нагре
вание проводят на водяной бане при температуре 100 °С. а затем на плитке с асбестовой сеткой.
Из полученного гидролизата под вакуумом отгоняют соляную кислотудо получения густогосиропа.
Затем добавляют 300 см3дистиллированной воды и снова отгоняют до получения густого сиропа.
Указанную операцию повторяют еще один раз.
Оставшуюся массу растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 3.5 5 н.
раствором едкого натра, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3 и доливают до метки
дистиллированной водой.
Добавляют 20 см3 активированного угля и периодически встряхивают в течение 1 ч. затем
полученную смесь фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтрат еще раз обрабатывают углем до полу
чения бесцветного или слабо-желтого раствора, который разливают в колбы вместимостью до 100
см3 и стерилизуют в автоклаве при 1 кгс/см2 в течение 20 мин и затем охлаждают. Раствор
хранят в холодильнике под слоем толуола.
5.5.2.2 Выращивание чистой культуры Е. coil штамм 113-3
Культуру выращивают в пробирках на агаровых косяках и хранят в холодильнике при
температуре 3-5 вС.
Состав агаровой среды в расчете на 100 см3:
- казеиновый кислотный 10 %-ный гидролизат — 6 см3;
- калий фосфорнокислый двузамещенный — 20 мг:
- железо сернокислое — 0.5 мг;
- магний сернокислый — 20 мг.
- аспарагин — 20 мг;
- глицерин — 200 мг;
- агар — 1.5 г:
- витамин В2 — 10 мкг:
- вода дистиллированная — до 100 см3.
В колбу вместимостью 100 см3наливают дистиллированную воду и последовательно растворяют
в ней первые четыре компонента.
Аспарагин отдельно растворяют вдистиллированной воде с прибавлением нескольких капель 1н.
соляной кислоты, а затем приливают к раствору в колбе. 1н. раствора едкого натра доводят рН-раствором
до 7.0. Избыток щелочи нейтрализуют 1 н. раствором соляной кислоты.
Краствору добавляют глицерин, агар идоливаютдистиллированной водойдо метки. Затем колбу с
содержимым подогревают на водяной бане до растворения агара, вносят витамин В2и смесь тщательно
перемешивают. Смесь разливают по 5 см3в пробирки и стерилизуют 15 мин под давлением 1кгс/см2.
Культуру раз в месяц пересевают на свежую агаровую среду и выдерживают в термостате в течение
24 ч при температуре 37 °С.
5.5.2.3 Приготовление основной среды
Состав среды в расчете на 1000 см3:
- калий фосфорнокислый двузамещенный — 7 г.
- калий фосфорнокислый однозамещенный — 3 г;
- натрий лимоннокислый — 0.5 г;
- магний сернокислый — 0,1 г;
- аммоний сернокислый — 1 г,
- глюкоза — 2 г,
- натрий хлористый — 0.5 г;
- натрий азотистокислый — 0.5 г или калий цианистый — 0.02 %-ный раствор — 5 см3;
- вода дистиллированная — до 1000 см3.
В колбу вместимостью 1000 см3наливаютдистиллированную воду и последовательно растворяют
в ней все компоненты. Затем доводят содержимое колбы дистиллированной водой до метки. Конечное
значение pH среды устанавливают 6.8-7.0.
5.5.2.4 Приготовление посевной культуры
Посевную культуру готовят за сутки до постановки опыта. Для этого пробирки с 10 см3основной
среды и витамином В2(из расчета 0.025 мкг в 1см3среды) или dl-метионином (из расчета 1 мкг в 1см3
среды) стерилизуют в автоклаве при 1 кгс/см2 в течение 20 мин и после охлаждения петлей вносят
культуру с агаровой среды.
Пробирки выдерживают в термостате 16-20 ч при температуре 37 °С. Полученную бактериальную
суспензию разводят стерильным 0.9 %-ным раствором хлористого натрия или стерильной основной
5