ГОСТ Р 57198—2016
кан, а ступкусмывают25 см3 растворасоляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм3 исмывдобавляютв
колбу.
Взвесь препарата выдерживают в течение 2—3 ч при комнатной температуре для экстракции
лизин, периодически взбалтывая, послечегосодержимоеколбы центрифугируютпри 2000 мин 1втече
ние 10—15 минифильтруютчерезбумажныйфильтр, получая таким образом разведение 1:10. Затем из
этого раствора готовят следующие разведения с помощью лимоннокислого буферного раствора (с уче
том предыдущего разведения 1:10):
- для кормовой концентрат лизина-10 — 1:1000; 1:2000:1:4000;
- для кормовой концентратлизина-40 — 1:4000; 1:8000:1:16000.
5.5.2.2 Подготовка чашек Петри с питательной средой и тест- культурой
Чашки Петри тщательно моют, стерилизуют в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре
160 °С.
В 6 чашек Петри заливают пипеткой по 15 см3расплавленной голодной агаровой среды, получая
нижнийслой. В 100 см3расплавленной иохлажденнойдо60—65 °Спитательнойагаровой среды вносят
1см3(10 международныхединиц мутности) тест-культуры Вас. subtilis 6633 и разливают в чашки Петри на
застывший нижний слой голодной агаровой среды по 7—8 см3.
После застывания агара в чашкахделают по 6 лунок буром, которые располагают по радиусам на
расстоянии 2,8 см от центра чашки с интервалом около 60 °С. В 6 лунок каждой из двух подготовленных
чашек Петри вносят капельницей около 0,1 см3рабочего стандартного раствора лизин. Чашки помеща
ют в термостат при температуре 37 °С и выдерживают в течение 16—18 ч, а затем измеряютдиаметры
зон задержки роста тест-микроба.
Дляпроведения испытаний препаратанасодержание в них лизин используютпартию питательной
агаровой среды, обеспечивающей после действия рабочего стандартного раствора лизин зоны задер
жкидиаметром от 17до 21 мм. В случаеполучениязон задержкидиаметром менее 17мм или более21 мм
готовят новую партию среды, подбирая новые серии компонентов, или увеличивают (уменьшают) коли
чество тест-микроба, вносимого в питательную среду, с целью достижения оптимального размерадиа
метразон задержки роста тест-микроба.
5.5.2.3 Построение градуировочного графика для определения активности лизин
Для построения градуировочногографика из раствора, содержащего 10 ЕД в 1см3,готовят 5 раст
воровконцентрациями 1,8; 2,4; 3,0; 3.8; 4.5 ЕД в 1см3. Раствор, содержащий3 ЕД в 1см3,является конт
рольным.
Полученныестандартные растворы, за исключением контрольного, капельницей вносят в 3 лунки
(по3 чашки на каждую концентрацию). Контрольный раствор вносят в остальные 3лунки всех 15 чашек.
Объем вносимых растворов (стандартного и контрольного) должен быть равным и составлять около
0.1 см3.Передработой капельницутщательно ополаскиваютбуферным раствором, а затем раствором,
который следует вноситьв каждуюлунку. Чашки выдерживают втечение 16—18ч в термостатепритем
пературе 37 °С, затем измеряютдиаметры зон задержки роста тест-культуры.
Для каждой концентрации рассчитываютсреднее арифметическоедиаметров зон задержки роста
по 3 чашкам. Для контрольной концентрации подсчитывают среднее арифметическое диаметров зон
задержки роста отдельно по 3 чашкам и по всем 15 чашкам, находят поправку, которая представляет
собой разность между средними арифметическими контрольных зон задержки роста, вычисленных по
15 ипо 3 чашкам.
Полученные поправки прибавляют к средним значениям диаметра зон задержки роста стандар
тных растворов концентрации 1,8:2.4; 3,0; 3,8; 4.5 ЕД в 1см3, вычисленныхпо 3 чашкам.
По полученным данным на полулогарифмической сетке строят градуировочный график. На ось
абсцисс наносят средние значения диаметра зон задержки роста стандартных растворов, полученных
после внесения поправки, а также среднее значение диаметра зоны контрольного раствора, вычислен
ное повсем 15 чашкам. На осиординат наносят соответствующие концентрации растворов.
Градуировочным графиком пользуются в течение двух месяцев, периодически проворяя угол
наклона кривой подвум концентрациям на 3—5 чашках.
5.5.3 Проведение испытания
На каждую пробу испытуемого препарата используют не менее 3 чашек.
Капельницей втри лунки каждой изчашеквносятрабочийстандартныйраствор, а втри другиелун
ки — один из растворов испытуемого препарата. Объем вносимых растворов рабочего стандартного
раствора ииспытуемого препаратадолженбыть равным и составлятьоколо 0.1 см3.Чашки выдержива
ют в течение 16— 18ч втермостате при температуре37 °С, затем измеряютдиаметр зон задержки роста
8