ГОСТ Р 51940-2002
D-МДГ — D-мал атдегидрогеназа;
Е—международная единица, определяющая количество (активность) фермента, кото
рый служит катализатором для превращения 1мкмоля вещества в минуту при 25 "С.
4 Сущность метода
Метод основан на ферментативном преобразовании |1, 2| D-яблочной кислоты в оксалоацетат
под действием НАД в присутствии D-МДГ и спектрофотометрическом измерении массовой кон
центрации образовавшегося НЛДН, эквиватагтного массовой концентрации D-яблочной кислоты
в пробе. Оксалоацетат в конце реакции распаляется на пируват и углекислый газ.
В ходе анализа протекает следующая ферментативная реакция:
D-МДГ
D-яблочная кислота + НАД* <> пируват + СО, + НАДН + Н*(1)
В связи с тем. что фермент D-МДГ не обтадает абсолютной специфичностью, при испытаниях
проб, содержащих наряду с D-яблочной L-винную кислоту, для связывания последней воздействуют
гидроокисью кальция и этиловым спиртом.
5 Реактивы
5.1 Общие требования
11рн проведении анализа используют реактивы х.ч., ч.д.а. и дистиллированную воду по
ГОСТ 6709.
Препараты НАД должны содержать не менее 90 % основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов для определения
D-яблочной кислоты и отдельные реактивы при условии, что качество реактивов не ниже указанного
в настоящем стандарте.
5.2 Стандартный набор состоит из трех реактивов.
5.2.1 Реактив 1 — HEPES-буфер (4- (2-гндроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновая кислота)
объемом 30 см’ и активной кислотностью 9,0 pH, содержащий стабилизаторы |3|.
5.2.2 Раствор реактива 2 — НАД
Флакон, содержащий 0.21 г лиофильно высушенного НАД |3|, растворяют в 4 см’ дистилли
рованной воды.
5.2.3 Раствор реактива 3 — D-МДГ удельной активностью около 13 Е/см’
Одну из трех содержащихся в наборе порций лиофильно высушенной D-МДГ |3| растворяют
в 0.6 см’ дистиллированной воды.
5.3 Кальция гидроокись по ГОСТ 9262.
5.4 Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 массовой долей основного вещества % %.
5.5 Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
6 Аппаратура
Обычная лабораторная аппаратура, а также:
6.1 Дозаторы пипеточные объемами доз 0,02; 0,05; 0.10; 0.50; 1,0; 2,0; 5,0 и 10 см3 и относи
тельной погрешностью дозирования ±1 % |4| или пипетки градуированные по ГОСТ 29227, номи
нальной вместимостью 0,02; 0,1; 0,2; 0.5; 1,0 и 2,0 см’, 2-го класса точности.
6.2 Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего
слоя 1 см для измерений при длинах ваш 334. 340 или 365 нм.
6.3 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 10 до 15 см для
перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.4 Спектрофотометр или фотометр фотоэлектрический для измерений при длинах волн 334,
340 или 365 нм. допускаемой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропус
кания ±1 %.
6.5 Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104. наибольшим пределом взвешива
ния 20 г, 2-го класса точности.
2