ГОСТ 33422—2015
- элюент В: 1 %*ный раствор муравьиной кислоты (в мерную колбу вместимостью 1000 см3
приливают 900 см3 дистиллированной воды и добавляют 10 см3 муравьиной кислоты, перемешивают и
доводят объем до метки дистиллированной водой).
Перед проведением анализа элюенты дегазируют на ультразвуковой бане.
Готовые растворы хранят в колбах с притертыми пробками, при температуре (4 ± 2) °С не более
1 мес.
8.3 Подготовка пробы
8.3.1 Предварительная подготовка пробы
Перед проведением анализа пробу предварительно высушивают на чашке Петри в сушильном
шкафу при температуре (103 ± 2) °С в течение 1 ч. Затем высушенную пробу обезжиривают по ГОСТ
23042 гексаном или петролейном эфиром в экстракционном аппарате Сокслета. Пробу взвешивают
до и после предварительной подготовки с записью результата взвешивания в граммах до третьего
десятичного знака.
8.3.2 Ферментативный гидролиз пробы
Пробу переносят в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе Трис-HCI до
массовойконцентрации 2 мг/см3 (плохо растворимые пробы рекомендуется предварительно
термостатировать на ультразвуковой бане с прогревом при 37 °С до полного растворения), затем
добавляют ферментный препарат (протеаза из Stroptomycos griseus) в количестве, составляющем
1/10 от массы пробы белка. Инкубируют 16 ч при 37 °С на водяной бане.
Гидролизат центрифугируют в течение 5 мин при 15000 об/мин для осаждения нерастворимых
продуктов. Супернатант пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.
8.3.3 Очистка гидролизата методом твердофазной экстракции (ТФЭ)
Патрон ТФЭ предварительно кондиционируют пропусканием последовательно 2 см3метанола и
2 см3дистиллированной воды. Отбирают 0.4 см3гидролизата пробы, приливают 0.1 см3ацетонитрила,
смесь наносят на патрон. Экстракцию с патрона осуществляют в две стадии:
последовательным элюированием 1 см3 метанола и 1.5 см3 смеси ацетонитрила с соляной
кислотой, собирая смывы. Элюент переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 см3и упаривают
досуха при 60 °С.
8.3.4 Дериватизация йодтирозинов (МИТ и ДИТ)
Сухой остаток растворяют в 0,3 см3 смеси бутанола с хлористым ацетилом и термостатируют
15 мин при 60 °С.
Растворитель упаривают досуха при 60 °С и растворяют сухой остаток в 0.4 см3 20 %-ного
раствора ацетонитрила. Перед анализом подготовленный дериват пропускают через мембранный
фильтр с диаметром пор 0. 45 мкм.
Если нет возможности провести анализ в тот же день, то подготовленные к анализу пробы
хранят в холодильнике при температуре от 4 вС до 6 °С не более 3 сут.
9 Проведение измерений
9.1 Хроматографические условия измерений
Условия проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа подбирают в зависимости от вида применяемого
жидкостного хроматографа, масс-слектрометрического детектора и хроматографической колонки.
В качестве примера могут быть приведены следующие условия определения йодтирозинов
(МИТ и ДИТ). выполненные на системе ВЭЖХ-МС/МС схроматографической колонкой С18,
4.6 х 50 мм. 1,8 мкм.
Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление растворов элюентов
по 8.2.5). Объем вводимой пробы — 0.01 см3.
Та б л и ц а
Время.
мин
1— Параметры и условия ВЭЖХ
Соотношение компонентов
подвижной фазы
СкоростьТемпература колонки. *С
потока.
см’.’мин
А. %
в.%
0.0
20800.630
2.090100.630
5.090100.630
5