ГОСТ ISO 20837—2013
c) очистка раствора ДНК и дальнейшее концентрирование путем преципитации этиловым спир
том в присутствии одновалентных катионов;
d) сбор преципитата ДНК с помощью центрифугирования;
e) промывка ДНК этиловым спиртом и ресуспендирование в буфере (например, буфер трис-(гид-
роксиметил)аминометан/ЭДТА (Трис-ЭДТА буфер) или Трис-буфер).
Для увеличения выхода ДНК на этапах преципитации можно использовать соосадители ДНК. на
пример гликоген, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или транспортную РНК (тРНК). Допускается использование
только соосадителей без нуклеазной активности. ПЦР-ингибирующих/конкурирующих эффектов и боз
гомологии последовательностей с потенциальными целевыми ПЦР-последовательностями анализиру
емых микроорганизмов.
П р и м е ч а н и е — Использование лиофильной сушки для высушивания осадка ДНК. полученного после
этапа преципитации, может привести к перекрестной контаминации.
ДНК может быть высвобождена путем температурного разрушения клеток (например при кипяче
нии в течение 10 мин). После кипячения охлажденный образец центрифугируют и полученный суперна
тант используют в ПЦР. Перед кипячением может быть применена ферментативная обработка для
улучшения разрушения клеток (например, лизоцим, мутанолизин для грамлоложительных бактерий),
после которой образец инкубируется с протеазами. Для микроорганизмов с исключительнопрочной кле
точной стенкой (например Mycobacterium spp.) возможно потребуется использование других методов,
например сильной встряски с шариками.
Для выделения нуклеиновых кислот могут быть использованы идругие методы, включая имеющи
еся в продаже наборы реагентов, при условии, что получаемые результаты сравнимы.
6.2.1.2 Качество и количество ДНК
Качество и выход ДНК. выделенной данным методом из данной матрицы, должны быть как повто
ряемыми. так и воспроизводимыми применительно к амплификации в ПЦР. при условии достаточного
содержания ДНК в матрице. В частности, применяемый метод должен обеспечивать получение фраг
ментов ДНК. средний размер которых больше или равен размеру исследуемых ПЦР-продуктов.
Концентрацию и чистоту выделенной ДНК можно оценить флуорометрическими методами или с
помощью электрофореза в геле. Количественная оценка очищенной ДНК может быть выполнена спек
трофотометрическими методами.
Электрофорез в агарозном геле с окраской бромистым этидием ифлуоресценцией в ультрафиоле
товом (УФ) свете является быстрым способом оценки качества и количества ДНК (см. (1)).
Для некоторых методов подготовкиобразцов(например кипячение) необходимо использовать рас
твор нуклеиновых кислот сразу же после приготовления, так как получаемые нуклеиновые кислоты не
стабильны.
В целом следует избегать повторных замораживания и размораживания растворов нуклеиновой
кислоты.
Для хранения нуклеиновых кислот с низким количеством копий используют подходящую пластико
вую посуду.
П р и м е ч а н и е — Некоторые материалы, используемые для изготовления пробирок, способны связывать
нуклеиновые кислоты.
6.3 Оценка результатов
Оценка результатов испытания — по ISO 22174. 9.3 и таблица 1.
3