Приложение В
(справочное)
ГОСТ ISO 20837—2013
Метод выделения ДНК из грамотрицательных бактерий
В.1 Применение
Данный метод применим для выделения ДНК из грамотрицательных бактерий путем лизиса или кипячения.
В.2 Состояние метода
Данный метод хорошо известен и широко применялся (1). Более того, данный метод прошел валидацию а со
вместном исследовании по обнаружению штаммов Salmonella в образцах сухого молока, прошедших культураль ное
обогащение на бульоне (2|, [3J, и совместном исследовании по обнаружению образующих веротоксин-
образующей Escherichia coll (VTEC) в рубленом мясе (4). [5].
В.З Принцип
В данном методе применяется несколько этапов центрифугирования для отбора бактерий. Бактериальные
клетки промываются, лизируются с помощью инкубации при температуре от 95 *С до 100 ‘ С. а затем центрифугиру
ются для преципитации остатков клеточных стенок, полисахаридов и белков, что позволяет в итоге получить экс
тракт нуклеиновых кислот.
Стартовым материалом обычно является питательный бульон для культурального обогащения.
В.4 Реактивы
В.4.1 Буфер для промывания, физиологический раствор {р (NaCt) = 9 г/дм*) или фосфатно-солевой буфер
ный раствор. ФСБ (р (NaCI) = 8 г/дм», р (KCI) * 0.2 г/дм3.р (NajHPO,) = 1.44 г/дм^.р <КН4Р 04) = 0.24 г/дм3; pH = 7.4).
В.5 Аппаратура и оборудование
Обычное лабораторное оборудование и. в частности, следующее.
В.5.1 Дозаторы с микропитровыми рабочими объемами
В.5.2 Настольная центрифуга, для микролитровых реакционных пробирок, с вместимостью от 1.5 см3 до
2 см3, и регулируемым ускорением до 10000 д.
B.S.3 Водяная баня или твердотельный термостат, для микролитровых реакционных пробирок, способных
выдерживать нагрев до 100 “С.
B.S.4 Мешалка, например вихревой смеситель.
В.6 Методика
В.6.1 Общие положения
После обогащения выделяют бактериальную ДНК согласно описанию в В.6.2.
В 6.2 Процедура выделения
Переносят 1 см3культуральной среды после обогащения в реакционную пробирку. Центрифугируют суспен
зию клеток в течение десяти минут при ускорении ЮОООд (В.5.2). Удаляют супернатант.
Ресуспендируют осадок в 1 см* буфера для промывки (В.4.1) или воды. Центрифугируют суспензию клеток в
течение десяти минут при ускорении ЮОООд (В.5.2). Удаляют супернатант.
Ресуспендируют осадок в объеме воды от 200 до 250 мкл. Проводят термическое разрушение клеток путем
нагрева до температуры 95 ’ С в течение 20 мин (для Salmonella) или до 100 “С в течение 15 мин (для шигатоксин-
продуцирующей Escherichia coll (STEC)).
Переносят реакционные пробирки в ледяную баню для быстрого охлаждения.
Тщательно перемешивают лизат (например с помощью встряхивателя (В.5.4))). Центрифугируют при темпе
ратуре от 20 °С до 25 *С в течение 3 мин при ускорении 10000д(5а^полеИа)или 10 с при ускорении 10000g(STEC).
Переносят супернатант в чистую микролитровую реакционную пробирку.
Если для экстрактов нуклеиновых кислот наблюдается по соответствующим контролем эффект ингибирова
ния. то они должны быть очищены перед использованием в ПЦР.
По выбору вместо методов термического разрушения клеток и необходимой очистки можно использовать
имеющиеся в продаже системы выделения и очистки ДНК при условии соблюдения инструкций производителя.
В.7 Валидация
Данный метод широко применяется и является основным методом в молекулярной биологии. Кроме того,
данный метод прошел валидацию в совместных межлабораторных испытаниях.
В 1998 году межлабораторное испытание было организовано рабочей группой «ПЦР для обнаружения пато
генных микроорганизмов в пищевых продуктах» института DIN (Немецким институтом стандартизации). В этом ис
пытании приняли участие двенадцать лабораторий, каждая из которых получила по 20 образцов. Материал
образца представлял собой сухое молоко с низким содержанием жира. Часть этого сухого молока была искусствен но
контаминирована Salmonella (1000 КОЕ на 25 г). Подготовка образцов перед выделением ДНК в лаборатории вы-
5