ГОСТ ISO 20837—2013
Обогащение и обработка образцов должны обеспечивать обнаружение малого количества целе
вых микроорганизмов и уменьшение количества веществ, ингибирующих ПЦР. Физические, химические
или биохимические процедуры, обладающие меньшим разрушающим эффектом на целостность нукле
иновых кислот, должны обеспечивать получение совместимых с ПЦР-амплификацией образца или рас
твора нуклеиновых кислот.
3.2 Обогащение и обработка образца
Обработка образцов может начинаться непосредственнос образца или после его обогащения, со
гласно описанию в перечисленных в приложении А стандартах или в других стандартах, относящихся к
данному вопросу.
3.3 Выделение нуклеиновых кислот
Основные принципы выделения нуклеиновых кислот состоят в высвобождении ДНК. присутствую
щей в бактериях, и одновременном или последующем удалении ингибиторов ПЦР
Пример метода выделения ДНК приводится в Приложении В. Этот метод является только приме
ром. и должен быть в дальнейшем модифицирован пользователями для соответствия задачам, стоя
щим перед каждой лабораторией.
4 Общие требования к лаборатории
Обработку образцов следует выполнять в раздельных рабочих зонах согласно требованиям стан
дарта ISO 22174. 6.3.
5 Реактивы, аппаратура и оборудование
См. приложения А и В настоящего стандарта, а также ISO 22174.
6 Методика
6.1 Обогащение и обработка образцов для выявления бактерий
Обогащение образцов пищевых продуктов следует проводить согласно соответствующим стан
дартам или другим нормативным документам. Для обогащения можно использовать другие, более со
вместимые с ПЦР, культуральные среды, если было установлено путем валидации, что они имеют
эффективность, сравнимую со средами, описанными в соответствующих стандартах.
Некоторые среды культурального обогащения, рекомендуемые стандартами, содержат меньшее
количество ингибирующих ПЦР веществ, чем другие, что должно тщательно учитываться при выборе
метода подготовки образцов.
Для некоторых продуктов необходимо принять специальные меры по подавлению роста конкури
рующих сопутствующих фоновых микроорганизмов (например путем добавления селективных добавок
или антибиотиков).
Могутбыть опробованы менее разрушающие методы, например простое разведение, центрифуги
рование. гидролиз белка, фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности, иммуномагнитная
сепарация и т.д. В случае отсутствия ответа в ПЦР возможно пробное использование более жестких ме
тодов, например кипячения, применения хелатирующих добавок или более жестких химикатов, напри
мер. хлороформа и этилового спирта, или наборов реагентов с аналогичными функциями. Для
снижения содержания жиров в веществах с высоким содержанием жиров могутбыть использованы про
стыв физические методы. Для уменьшения эффектов ингибирования, обусловленного высоким содер
жанием кальция в молочных продуктах, можно использовать хелатирующие агенты.
6.2 Выделение нуклеиновых кислот
6.2.1 Выделение ДНК
6.2.1.1 Высвобождение и очистка ДНК
Допускается комбинация нескольких принципов выделения ДНК. Например, могут быть выполне
ны следующие этапы:
a) разрушениебелков в экстракте клеток с помощью протеаз (например, протеиназы К) и РНК с по
мощью рибонуклеаз.
b
) преципитация образовавшихся пептидов с органическими растворителями (например, со
смесью фенола и хлороформа), что позволяет оставить ДНК в водной фазе:
2