ГОСТ 32148—2013
6.4 Выделение и очистка ДНК
6.4.1 От приготовленных по 6.3.2—6.6.5 проб отбирают с помощью автоматического дозатора
100—150 мм3 жидкого яичного меланжа или 50— 100 мм3 жидкого яичного желтка или с помощью
одноразового шпателя отбирают 75—100 мм3 (по насыпному объему) сухого яичного продукта
или 100—150 мм3 (по насыпному объему) яичного полуфабриката или кулинарного изделия, и
помещают в одноразовую микропробирку вместимостью 1,5 см3, которую затем маркируют. Для
каждой пробы гото вят три параллельные пробирки с яичным продуктом.
Минимальная массаотобраннойдля выделенияДНК пробы: сухие яичные продукты — 15 мг, жид
кие яичные продукты, яичные полуфабрикаты или кулинарные изделия — 50 мг. При необходимости
отбираемый объем пробы предварительнооценивают с помощью взвешивания с записью результата в
миллиграммах.
6.4.2 Лизисклеток,сорбциюи очисткуДНК проводят поГОСТ31719в пробиркахсподготовленной
по 6.3.5 пробой-
6.4.3 Приготовленный по 6.4.2 очищенный экстракт ДНК переносят в чистую микропробирку, не
задеваяпри этом осадка, посколькупопадание внее сорбента может вдальнейшем приводитькингиби-
ровакию ПЦР. Полученный экстракт ДНК используют для проведения амплификации и при необходи
мости хранят при температуре 4 °С не более 1 мес или при температуре минус 18 °С не более
одного года.
6.4.4 В чистую микропробирку отбирают 0,03—0,08 см3ТЕ-буфера (элюирующего раствора) по
ГОСТ31719и используютпри проведенииамплификации вкачествеконтрольнойотрицательнойпробы
(проба К-).
7 Проведение анализа
Для выявления фрагментоввидоспецифичнойДНК растений и животных используют наборы реа
гентовдля амплификации методом ПЦР. содержащие праймеры 4, специфичные кДНК определенного
вида птиц.
7.1 Амплификация фрагментов видоспецифичной ДНК птиц с детекцией продуктов
амплификации методом электрофореза
7.1.1 В штативе размещают и маркируют необходимое число микропробирок с лиофильно высу
шеннойамплификационнойПЦР-смесьюпоГОСТ31719(трипробиркидля каждойпробы), включаяпро
бирки для положительного и отрицательного контролей.
7.1.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью при помощи автоматического дозатора по
ГОСТ 31719 последовательно вносят 10 мм3ПЦР-растворителя по ГОСТ 31719 и 5 мм3смеси прайме
ров4 для выявления фрагмента видоспецифичнойДНК птиц. Перед использованием смесь праймеров
необходимо разморозить в твердотельном термостате по ГОСТ 31719 при температуре 4 X , переме
шатьна микроцентрифуге-встряхивателе в течение 5—10с. а затем собрать осаждением надно микро
пробирки путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе по ГОСТ 31719 при
2000об/мин втечение 3—5 с. Последующую работус праймерами рекомендуется проводитьпри темпе
ратуре от 2 °С до 4 X с использованием твердотельного термостата с охлаждением по ГОСТ 31719
7.1.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного контрольного образца вносят 5 мм3
ТЕ-буфера (отрицательная контрольная проба К-), подготовленного по 6.1. Затем в микропробирки с
ПЦР-смесьюдобавляютпо5 мм3экстрактаДНК(6.4.2)(три пробиркидля каждогоизисследуемыхобраз
цов). Впоследнюю очередь в микропробиркус ПЦР-смесью для положительногоконтрольногообразца
вносят 0.005 см3положительной контрольной пробы (К+).
7.1.4 Содержимое микропробирок растворяют путем легкого перемешивания намикроцентрифу
ге-встряхивателе. После этогособирают осаждением капли ПЦР-смеси состенок микропробирок путем
центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе по ГОСТ 31719 при 2000 об/мин в течение
3—5 с.
7.1.5 Еслидля проведения амплификации используетсяамплификаторбезнагреваемой крышки,
то в каждую микропробирку добавляют по 0,020—0,025 см3(две капли) вазелинового масла.
7.1.6 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют в течение 5—7 с на микроцентрифу
ге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор по ГОСТ 31719 для проведения ампли
фикации по программе, указанной в таблице 1. Поокончании действия программы пробирки извлекают
из амплификатора и в штативе передают на этап детекции продуктов ПЦР методом электрофореза.
6