ГОСТ 28086—2013
лика (RK-13) или первично трипсинизированной культурой клеток почки кролика возраста 2-5 сут. На
каждое разведение материала (103 - 10’7) берут по четыре пробирки. Перед внесением вируса рос
товую среду предварительно удаляют. Пробирки инкубируют в течение 6-7 сут при температуре (33.0 ±
0,5) ’ С и. начиная со вторых суток, ежедневно просматривают на наличие цитолатогенного дейст вия
(ЦПД) вируса.
6.8.2.3 Проведение испытаний микрометодом в планшетах для культуры клеток (альтернатив
ный метод)
Культуру клеток RK-13 выращивают до образования полного монослоя в лунках 96-луночных
планшетов. Перед внесением исследуемого материала иадосадочную жидкость удаляют встряхива
нием пластин. Для определения биологической активности готовят десятикратные разведения вирус
содержащего материала от 10 ’до 10’7на питательной среде Игла МЕМ с добавлением 1.0 %-ной сы
воротки крови эмбрионов крупного рогатого скота, и вносят по 0.2 см: в четыре вертикальных ряда
лунок (т.е. в четырех повторностях). Два вертикальных ряда лунок оставляют как контроль культуры
клеток. Клетки инкубируют в течение 6-7 сут при температуре (33.0 ± 0.5) °С в атмосфере влажно
стью 95.0 % и содержанием С02- 5.0 %. Лунки планшета, начиная со вторых суток, ежедневно про
сматривают на наличие ЦПД вируса.
6.8.2.4 Обработка результатов
Инфекционную активность вируса оценивают по наличию ЦПД вируса миксоматоза в культуре
клеток. Титр вируса высчитывают по методу Кербера в модификации Ашмарина, выражая его в лога
рифмах тканевого цитолатического действия вируса (50 %), давшего положительный результат (ЦПД)
—1д ТЦДыисД
Логарифм тканевого цитолатического действия вируса (50 %), давшего положительный ре
зультат (ЦПД). 1д ТЦЦгсси3вычисляют по формуле
lg TlWsocu = lg DN - б (XU - 0.5).(1)
где DN - максимальная из испытанных доз вакцины, давшая положительный результат
(ЦПД):
б - логарифм кратности разведения:
£ - сумма значений для всех испытанных доз;
Li - отношение числа культур клеток давших положительную реакцию от заражения дан
ной дозой, к общему числу культур клеток, зараженных этой дозой;
0.5 - постоянная величина.
6.9 Определение иммуногенной активности вакцины
6.9.1 Определение иммуногенной активности вакцины по индексу нейтрализации вак
цинного вируса
6.9.1.1 Материалы и животные - по 6.7.1.
6.9.1.2 Проведение испытания
Готовят смешанную пробу вакцины по 6.7.2 и из смеси готовят разведения таким образом, что
бы в конечном разведении содержалось 3.0 1gи вводят четырем кроликам внутримышечно в
область бедра в объеме 1.0 см3. Контрольную группу из двух кроликов оставляют не
вакцинирован ными и содержат отдельно.
Через девять суток четырем вакцинированным и двум контрольным кроликам вводят вакцину
в разведениях от 10’ до 10* внутрикожно по 0.25 см3в четыре точки бесшерстного участка кожи по
6.7.2. Через 7 - 10 сут учитывают результаты титрования, обращая внимание на местную реакцию -
образование миксом в местах введения вируса.
6.9.1.3 Обработка результатов
В каждой группе (вакцинированной и контрольной) рассчитывают инфекционный титр вируса,
входящий в состав вакцины и выражают его в 1д ИД sa’c«3 по 6.7.3.
Вакцину считают иммуногенной, если средний титр вируса в группе вакцинированных кроли
ков ниже не менее, чем на 3.0 lg по сравнению с титром на контрольных животных.
6.9.2 Определение иммуногенной активности вакцины при заражении вирулентным ви
русом
6.9.2.1 Материалы и животные - по 6.7.1 с дополнением:
- штамм вируса миксомы вирулентный, используемый для заражения кроликов.
6.3.2.2 Проведение испытания
Готовят смешанную пробу вакцины по 6.7.2 и из смеси готовят разведение таким образом, что
бы в конечном разведении содержалось 3.0 1д ИДкл«3 и вводят четырем кроликам внутримышечно в
область бедра в объеме 1.0 см . Контрольную группу из двух кроликов оставляют не привитыми и со
держат отдельно.
7